尚煜超，劉向榮,2，石 晨，楊再文,2，趙順省,2

(1.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西省西安市，710054；2.自然資源部煤炭資源勘查與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省西安市，710021)

0 引言

腐殖酸(Humic acid,HA)是一種天然高分子有機(jī)物，廣泛分布于土壤、水體及低階煤中[1]。腐殖酸含有大量活性官能團(tuán)，如羧基、酚羥基、羰基、磺酸基和甲氧基，這些活性官團(tuán)使其具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、與重金屬絡(luò)合固定重金屬離子減少重金屬富集和毒害作用以及抗病毒和抗炎活性的能力。因此，腐殖酸廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、衛(wèi)生、廢水處理等方面[2-5]。

我國(guó)煤中腐殖酸資源較為豐富，原生腐殖酸含量為10%～80%[6-7]，目前從煤中提取腐殖酸方法較多，主要有酸抽提法[8]、堿抽提法[9]及微生物溶解法[10]3種。酸抽提法具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但也存在使用大量化學(xué)試劑、成本高、污染環(huán)境等缺點(diǎn)，同時(shí)也受到其提取雜質(zhì)較高而有所限制；堿抽提法因操作簡(jiǎn)單、提取率較高最為常用，但是堿抽提法也存在使用大量化學(xué)試劑、成本高、污染環(huán)境等缺點(diǎn)；微生物溶解法是20世紀(jì)初開始研究的一種煤炭轉(zhuǎn)化新方法，通過微生物溶解法提取腐殖酸具有反應(yīng)條件溫和、清潔無污染、產(chǎn)品生物活性高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在腐殖酸提取率相對(duì)較低的缺點(diǎn)[6,11-12]。

Huculak-M?czka M等人[13]的研究表明，煤中腐殖酸提取程度及其結(jié)構(gòu)的決定因素主要是提取劑的類型，使用NaOH溶液可以獲得較大的腐殖酸提取率，使用Na4P2O7溶液腐殖酸提取率較低，在結(jié)構(gòu)上與NaOH溶液提取的腐殖酸相比有著分子量小、羧基含量較高的特點(diǎn)；DONG L等人[10,14]的研究表明，微生物處理煤產(chǎn)生的腐殖酸與堿抽提法相比提取率較低，但其所得的腐殖酸水溶性腐殖物質(zhì)大大增加，生物活性更好。我國(guó)煤炭資源豐富，富油煤在我國(guó)西部?jī)?chǔ)量豐富，是一種中低成熟度的油氣資源，焦油產(chǎn)率大于7%，目前的利用方式主要是作為動(dòng)力煤燃燒，其在使用過程中污染嚴(yán)重，極易造成大氣污染[15]。通過微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)以清潔無污染的方式用于燃料和非燃料化學(xué)品的生產(chǎn)，可為富油煤的利用開辟更具效益的前景，也有利于早日實(shí)現(xiàn)“雙碳”的目標(biāo)。

本文利用單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)確定了熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌降解郭家溝富油煤提取生物腐殖酸的(bHA)的最佳工藝條件，并通過元素分析、UV-vis、FTIR、XRD及有機(jī)質(zhì)元素分析的表征方法對(duì)生物提取的腐殖酸和堿抽提法所得的腐殖酸進(jìn)行了對(duì)比分析，為生物腐殖酸在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 煤樣制備

實(shí)驗(yàn)所用煤樣為陜西省榆林市郭家溝富油煤，焦油含量為7.25%，利用球磨機(jī)將其破碎并進(jìn)行篩分，獲得粒徑為0.25～0.50 mm的樣品，用10 mol/L的硝酸對(duì)原煤氧化48 h，并用去離子水洗滌至中性，烘干、滅菌后備用。根據(jù)《煤的工業(yè)分析方法》(GB/T212-2008)和《煤的元素分析》(GB/T31391-2015)的方法利用Perkin Elmer 2400分析儀和5E-S3200庫侖硫分析儀對(duì)硝酸氧化前后的煤樣進(jìn)行工業(yè)分析和元素分析，氧化前后煤樣的工業(yè)分析和元素分析見表1。

由表1可以看出，原煤經(jīng)硝酸氧化后C、H、S含量降低，O、N含量增加，灰分變化不大，揮發(fā)分降低，這是由于硝酸與煤樣反應(yīng)，芳香環(huán)羧基化，側(cè)鏈烷基氧化和硝化的原因[12]。

表1 氧化前后煤樣的工業(yè)分析和元素分析 %

1.2 菌種的培養(yǎng)

由于富油煤油氣含量較高的屬性，選取了降解原油效果較好的棒狀桿菌屬[16]的2種細(xì)菌，即熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)和蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，均購(gòu)買于中國(guó)微生物菌種保藏中心(CICC)，編號(hào)分別為CICC 20066和CICC 21290。培養(yǎng)基均采用CICC所提供的牛肉膏培養(yǎng)基配方，即牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、氯化鈉5 g、去離子水1 L。將菌種接種于裝有50 mL牛肉膏培養(yǎng)基的錐形瓶?jī)?nèi)，并置于恒溫30 ℃且160 r/min的搖床內(nèi)振動(dòng)培養(yǎng)。

1.3 煤樣腐殖酸的提取

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在含0.3 g滅菌煤樣的150 mL錐形瓶中加入50 mL滅菌的牛肉膏培養(yǎng)基和10 mL菌液，置于恒溫30 ℃、160 r/min的振動(dòng)培養(yǎng)箱振動(dòng)培養(yǎng)。在相同培養(yǎng)條件下分別改變煤漿濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/50 mL)、提取時(shí)間(2、4、6、8、10、12、14、16 d)、菌液用量(2、4、6、8、10、12、14、16、18 mL/50 mL)研究各因素對(duì)煤樣腐殖酸提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)束離心操作(10 000 r/min，20 min)后分離固相產(chǎn)物和液相產(chǎn)物備用。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)得出熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌降解郭家溝富油煤提取腐殖酸的最佳工藝條件，正交實(shí)驗(yàn)因素及水平見表2。

表2 2種細(xì)菌降解氧化煤提取腐殖酸的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3 腐殖酸提取率的計(jì)算

腐殖酸提取率的計(jì)算見式(1)[3]：

(1)

式中：ε——腐殖酸提取率，%；

m1——起始煤樣的質(zhì)量，g；

Mad——氧化煤中的含水量，%；

m2——?dú)埫旱馁|(zhì)量，g。

將離心后所得固相產(chǎn)物用蒸餾水洗滌至無菌體殘留，干燥稱重，通過式(1)計(jì)算腐殖酸提取率。

1.3.4 生物腐殖酸和化學(xué)腐殖酸的提取方法

生物腐殖酸提取：將離心后的液相產(chǎn)物用0.22 μm微膜過濾器進(jìn)行過濾后獲得濾液，用6 mol/L的HCl酸化至pH<2的沉淀腐殖酸，并通過離心(4 000 r/min，20 min)儀器進(jìn)一步分離腐殖酸，然后再利用Spectrapore膜(MWCO 3500)純化和透析腐殖酸，直到游離氯離子被洗掉，最后冷凍干燥，獲得2種生物腐殖酸(bHA)。

化學(xué)腐殖酸提?。河?.1 mol/L的NaOH和0.1 mol/L的焦磷酸鹽溶液從氧化煤中抽提，比例為1∶10(煤樣∶萃取劑)，然后再通過上述步驟提取獲得化學(xué)腐殖酸(cHA)[17]。

1.4 腐殖酸表征方法

采用Perkin Elmer 2400分析儀和5E-S3200庫侖硫分析儀對(duì)提取腐殖酸樣品進(jìn)行S元素分析；使用TU1950 型紫外可見分光光度計(jì)(UV-Vis)測(cè)定腐殖酸樣品E4/E6(465 nm/665 nm)比率；通過Nicolet iN 10 &iZ10型傅里葉紅外光譜儀定量溴化鉀壓片法(固相產(chǎn)物∶KBr為1 mg∶200 mg)，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)，分辨率4 cm-1對(duì)腐殖酸樣品進(jìn)行紅外光譜掃描；利用Mini Flex 600 X-射線衍射儀對(duì)腐殖酸樣品進(jìn)行分析，掃描范圍為5°～80°，掃描速度為2°/min；使用KDN-520型凱氏定氮儀和TITAN 10型微波消解儀通過凱士定氮法和火焰光度法對(duì)腐殖酸的N、P、K、Ca、Mg元素進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單因素對(duì)生物腐殖酸提取率的影響如圖1所示。

由圖1(a)中可以看出，隨著煤漿濃度的增加，熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌對(duì)煤樣中腐殖酸的提取率均先增加后降低。在煤漿濃度分別為0.5 g/50 mL和0.6 g/50 mL時(shí)，達(dá)到的最優(yōu)提取率分別為31.20%和33.22%。原因可能是當(dāng)煤漿濃度過大時(shí)抑制了熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)。

由圖1(b)中可以看出，隨著降解天數(shù)的增加，熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌對(duì)煤樣中腐殖酸的提取率均呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的現(xiàn)象，均在提取12 d時(shí)處于緩慢增長(zhǎng)期，提取率分別為29.08%和33.55%。原因可能是在降解時(shí)間達(dá)到12 d時(shí)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)幾乎被細(xì)菌消耗，部分細(xì)菌趨于死亡[18]，使得12 d后的腐殖酸提取率變化不大。

由圖1(c)中可以看出，隨著菌液用量的增加，熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌對(duì)煤樣中腐殖酸的提取率均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，分別在菌液用量為10 mL/50 mL和12 mL/50 mL時(shí)，對(duì)煤樣中腐殖酸的提取率達(dá)到最大，分別為29.02%和34.51%。這是由于菌液接種量較低時(shí)，煤漿環(huán)境對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有抑制作用，隨著菌液接種量的增加抑制作用減弱，當(dāng)接種量超過一定數(shù)值后，有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)菌之間的競(jìng)爭(zhēng)和抑制，從而影響了對(duì)煤樣腐殖酸的提取效果。

圖1 單因素對(duì)生物腐殖酸提取率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌提取郭家溝富油煤腐殖酸的正交實(shí)驗(yàn)見表3和表4。

對(duì)表3和表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后得出，根據(jù)各因素的K1、K2和K3值的熒光假單胞菌在最優(yōu)工藝組合為A2、B3、C3，即煤漿濃度0.5 g/50 mL、提取時(shí)間14 d、菌液用量12 mL/50 mL時(shí)煤樣腐殖酸的提取率最高，為32.87%；蠟樣芽孢桿菌在最優(yōu)工藝組合為A1、B3、C1，即煤漿濃度0.5 g/50 mL、提取時(shí)間14 d、菌液用量8 mL/50 mL時(shí)對(duì)煤樣腐殖酸提取率最高，為38.23%。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的極差R可以看出3個(gè)因素對(duì)熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌提取腐殖酸的影響由大到小分別為：降解時(shí)間>煤漿濃度>菌液用量和菌液用量>降解時(shí)間>煤漿濃度。

表3 熒光假單胞菌降解氧化煤提取腐殖酸正交實(shí)驗(yàn)

表4 蠟樣芽孢桿菌降解氧化煤提取腐殖酸正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 腐殖酸的表征結(jié)果

2.3.1 元素分析

按照1.4中方法提取的腐殖酸元素，bHA(1)和bHA(2)分別為熒光假單胞菌和蠟樣芽孢桿菌降解產(chǎn)生的腐殖酸，cHA為堿抽提法提取的腐殖酸。腐殖酸樣品的元素分析結(jié)果見表5。

表5 腐殖酸樣品的元素分析結(jié)果

由表5可以看出，2種細(xì)菌降解生成的腐殖酸元素組成差別不大，與化學(xué)方法提取的腐殖酸相比，H、N及S含量較高，O、C含量較低；H/C原子比代表芳香度，H/C越低則意味著芳香度和分子量越高，2種細(xì)菌降解產(chǎn)生的腐殖酸H/C原子比幾乎相同并大幅高于化學(xué)方法提取的腐殖酸，這說明細(xì)菌降解生成的腐殖酸含有更多的脂肪族化合物，芳香度和分子量較低；O/C原子比反映腐殖酸中的氧含量，2種細(xì)菌降解產(chǎn)生的腐殖酸與化學(xué)腐殖酸相比O/C原子比較低，表明2種生物腐殖酸比化學(xué)腐殖酸的含氧官能團(tuán)少[2,14]；N/C原子比反映了腐殖酸中的氮含量，通常煤衍生腐殖酸的N/C值通常在0.05左右，2種生物腐殖酸的N/C比較高可能是其均具有脫氨基能力[17]。

2.3.2 紫外分析

不同波長(zhǎng)下的UV-Vis比值被用作腐殖酸的重要表征指標(biāo)，E4/E6(465 nm/665 nm)是最常用的吸光度比，E4/E6比率主要與腐殖酸的分子量及芳香度相關(guān)，通常E4/E6值隨分子量和芳香度的增加而降低，同時(shí)，該比值還會(huì)隨著氧含量的增加而增加。3種腐殖酸樣品的紫外E4/E6比率見表6。

表6 腐殖酸樣品E4/E6比率

由表6可以看出，E4/E6比率表明2種生物腐殖酸擁有比化學(xué)腐殖酸高的分子量和芳香度，這與元素分析結(jié)果相矛盾，這可能是由于化學(xué)腐殖酸中含氧量較高引起其E4/E6比值升高[14,19]。

2.3.3 紅外光譜分析

為進(jìn)一步了解腐殖酸的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)排列，并對(duì)比生物腐殖酸和化學(xué)腐殖酸的芳香度及含氧結(jié)構(gòu)參數(shù)，對(duì)3種腐殖酸的FTIR分析如圖2所示。

圖2 3種腐殖酸的FTIR分析

由圖2中可以看出，3種腐殖酸樣品的紅外光譜特征峰及主要特征峰的出現(xiàn)位置基本相同。3 425 cm-1處的吸收峰是N-H或羥基(OH)伸縮振動(dòng)的標(biāo)志，吸收峰位于2 930 cm-1和2 804 cm-1歸因于脂肪族CH3和CH2的C-H伸縮振動(dòng)，吸收峰位于1 635 cm-1是羧酸的O=C伸縮振動(dòng)，2 625 cm-1的吸收峰是由羧酸中OH伸縮振動(dòng)引起的，在1 533 cm-1處的吸收峰為硝基伸縮振動(dòng)引起的[18]，吸收峰在1 385 cm-1是由酚羥基的OH變形和C-O拉伸振動(dòng)引起的，同時(shí)，吸收峰位于762 cm-1表示芳香族C-H的拉伸振動(dòng)[2]。FTIR光譜的吸收峰主要分為4個(gè)區(qū)域：3 600～3 000 cm-1波段羥基(-OH)的吸收區(qū)，3 000～2 800 cm-1波段脂肪族結(jié)構(gòu)的吸收區(qū)，1 800～1 000 cm-1波段含氧結(jié)構(gòu)的吸收區(qū)，900～700 cm-1波段的芳環(huán)結(jié)構(gòu)的吸收區(qū)[20]，對(duì)這4個(gè)吸收峰分別進(jìn)行擬合，得到高斯峰，并確定其面積、半峰寬等參數(shù)，從而確定fa(芳香度)、C'(含氧結(jié)構(gòu)參數(shù))[21]。3種腐殖酸樣品的紅外分峰擬合如圖3～圖5所示。

圖3 bHA(1) FTIR分峰

圖4 bHA(2) FTIR分峰

圖5 cHAFTIR分峰

腐殖酸FTIR擬合結(jié)構(gòu)參數(shù)fa和C′見表7。

表7 腐殖酸FTIR擬合結(jié)構(gòu)參數(shù)

由表7可以看出，2種生物腐殖酸的芳香度相差不大，與化學(xué)腐殖酸相比芳香度較低，說明這2種生物腐殖酸含有脂肪族鏈較多，低分子化合物較多；從C'可以看出，這2種生物腐殖酸含氧官能團(tuán)含量相差不大，都小于化學(xué)腐殖酸含氧官能團(tuán)數(shù)量，這與元素分析的結(jié)果一致，這也解釋了紫外分析中化學(xué)腐殖酸E4/E6比值大于生物腐殖酸，是由于化學(xué)腐殖酸含氧官能團(tuán)含量較高引起的。

2.3.4 XRD分析

為了解生物腐殖酸和化學(xué)腐殖酸在微晶結(jié)構(gòu)方面的差異，通過X-射線衍射對(duì)3種腐殖酸樣品的XRD分析如圖6所示。

圖6 3種腐殖酸樣品的XRD分析

由圖6可以看出，3種腐殖酸樣品均顯示出高背景強(qiáng)度，在26°附近出現(xiàn)清晰的002峰，40°附近出現(xiàn)100峰，002峰和100峰分別表示煤中芳香結(jié)構(gòu)單元的平行取向度和平面延伸度，002峰具有對(duì)稱性，而圖6中未表現(xiàn)出不對(duì)稱性，表明此處呈現(xiàn)的峰由γ和002擬合峰的疊加組成[22]。

使用Origin Pro繪圖軟件對(duì)10°～45°范圍內(nèi)的光譜進(jìn)行峰值擬合，首先對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正和平滑處理，然后對(duì)平滑后的曲線進(jìn)行擬合，曲線擬合過程中獲得的參數(shù)，如峰位、強(qiáng)度、全寬半最大值(FWHM)、面積，用于計(jì)算腐殖酸樣品的層間距(d002)、微晶平均直徑(La)、微晶平均高度(Lc)和碳層數(shù)(N)[23-24]。XRD分峰擬合如圖7所示，分峰擬合數(shù)據(jù)見表8。

圖7 3種腐殖酸XRD分峰

表8 3種腐殖酸XRD擬合結(jié)構(gòu)參數(shù)

由表8可以看出，2種生物腐殖酸及化學(xué)腐殖酸的La和Lc差別較大，La和Lc共同反映了煤中的微晶尺寸，3種腐殖酸的微晶尺寸差別較大，可能是由于2種細(xì)菌及堿抽提法提取腐殖酸的作用部位有差異引起的；對(duì)比3種腐殖酸的d002和N，2種生物腐殖酸的d002與化學(xué)腐殖酸相比較大，N較小，表明2種生物腐殖酸有比化學(xué)腐殖酸大的芳香層片間距和少的碳層數(shù)。

2.3.5 腐殖酸營(yíng)養(yǎng)元素測(cè)定

3種腐殖酸營(yíng)養(yǎng)元素含量見表9。

表9 3種腐殖酸營(yíng)養(yǎng)元素含量

由表9可以看出，2種生物腐殖酸的N、P、K、Ca、Mg含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于化學(xué)腐殖酸，N、P、K為土壤的大量元素，是作物生長(zhǎng)所必須的營(yíng)養(yǎng)元素，Ca、Mg等雖為微量元素，但也是作物生長(zhǎng)過程中不可或缺的元素[25-26]。同時(shí)這些營(yíng)養(yǎng)元素也分為全量元素和有效態(tài)元素，有效態(tài)元素才是可以被植物所吸收的元素，腐殖酸有助于提高營(yíng)養(yǎng)元素的有效性，使其更容易被作物吸收[27]。生物腐殖酸含有遠(yuǎn)高于化學(xué)腐殖酸的營(yíng)養(yǎng)元素，配合腐殖酸提高營(yíng)養(yǎng)元素的有效性，使得生物腐殖酸比化學(xué)腐殖酸作為農(nóng)作物營(yíng)養(yǎng)源更具優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

(1)通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得到了熒光假單胞菌在煤漿濃度0.5 g/50 mL、提取時(shí)間14 d、菌液用量12 mL/50 mL時(shí)對(duì)煤樣腐殖酸的提取率最高，為32.87%；蠟樣芽孢桿菌在煤漿濃度0.5 g/50 mL、提取時(shí)間14 d、菌液用量8 mL/50 mL時(shí)對(duì)煤樣腐殖酸提取率最高，為38.23%。

(2)元素分析、UV-vis和FTIR分析表明，2種生物腐殖酸與化學(xué)腐殖酸相比擁有有較小的分子量、低的芳香度和較少的含氧官能團(tuán)；XRD分析表明，2種生物腐殖酸相較于化學(xué)腐殖酸有較大的芳香層片間距和較少的碳層數(shù)。

(3) 3種腐殖酸的營(yíng)養(yǎng)元素含量測(cè)定表明2種生物腐殖酸的N、P、K、Ca、Mg的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于化學(xué)腐殖酸，這種差異會(huì)使生物腐殖酸在作為農(nóng)作物營(yíng)養(yǎng)源時(shí)更具優(yōu)勢(shì)。另外，微生物提取反應(yīng)條件溫和，清潔無污染。

(4)利用微生物降解富油煤提取腐殖酸的最高產(chǎn)率相對(duì)堿提取法降低了4.47%，但是微生物降解的工藝條件溫和、清潔無污染，而且生物腐殖酸具有遠(yuǎn)高于化學(xué)腐殖酸的營(yíng)養(yǎng)元素，作為農(nóng)作物營(yíng)養(yǎng)源更具優(yōu)勢(shì)。因此，本研究為富油煤的清潔和高價(jià)值轉(zhuǎn)化提供新途徑。