李洪波，高學飛，李 娜，吳東海

（1．懷化學院生命科學系，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化 418008；2．中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東廣州 510530）

人C1q／TNFα相關蛋白-6的表達、純化及生物活性分析

李洪波1，2，高學飛2，李 娜2，吳東海2

（1．懷化學院生命科學系，民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南懷化 418008；2．中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院，廣東廣州 510530）

中國圖書分類號：R-332；R378.21；R341；R394.2；R977．6

摘要：目的 利用大腸桿菌表達可溶性hCTRP6蛋白并分析其活性。方法 重組載體轉化大腸桿菌表達菌株、IPTG誘導表達、純化后測定活性。結果 Trx-hCTRP6蛋白在大腸桿菌中高效表達，經(jīng)鎳親合純化和分子篩純化，Trx-hCTRP6在細胞和動物水平上都有生物活性。結論 利用大腸桿菌表達系統(tǒng)高效制備了具有生物活性的Trx-hCTRP6蛋白。

關鍵詞：C1q／TNFα相關蛋白-6；大腸桿菌；重組蛋白；親合純化；蛋白印跡；分子篩

網(wǎng)絡出版時間：2015－7－22 10：42 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150727．0901．030．html

C1q／腫瘤壞死因子相關蛋白（C1q and tumor necrosis factor related proteins，CTRPs）是一類在結構和功能上與脂聯(lián)素類似的蛋白［1－5］。所有CTRPs蛋白都以三聚體作為分泌的基本結構單元，可以形成6聚體、12聚體、18聚體以及更高形式的多聚體；CTRP3、CTRP5、CTRP6和CTRP10的三聚體通過二硫鍵進一步聚集成更有序的低聚物；除了形成同源低聚物，CTRP1／CTRP6、CTRP2／CTRP7和脂聯(lián)素／CTRP2可以作為異源低聚體分泌［1－5］。不同CTRPs間的生物功能各異，例如：CTRP1特異性結合膠原纖維并阻斷膠原介導的血小板聚集，阻止血栓形成，且具有降血糖功能，能增加胰島素敏感性等；CTRP2球狀結構域具有增加肝臟糖原合成、促進脂肪酸的氧化及胰島素增敏作用；CTRP-3能夠抑制趨化因子的釋放，CTRP5在眼部發(fā)育過程中起一定的作用，CTRP11與脂肪形成有關，CTRP13激活AMP的磷酸化并參與脂肪酸的代謝調(diào)節(jié)［2－5］。CTRP6可以誘導巨噬細胞白細胞介素-10（IL-10）的表達。CTRP6球狀區(qū)（gCTRP6）劑量依賴性地增加IL-10的表達水平，并且gCTRP6可以迅速誘導ERK1／2的磷酸化。使用選擇性抑制劑U0126后，CTRP6誘導的IL-10表達被阻斷。由于IL-10是一個有效的抗炎細胞因子，可以調(diào)節(jié)炎癥信號通路，所以CTRP6可能是一個抗炎藥物的新靶點；另外，CTRP6球狀區(qū)可以在骨骼肌細胞中調(diào)節(jié)磷酸化并激活AMPK。在肌細胞中，CTRP6誘導乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的磷酸化和脂肪酸氧化，CTRP6在能量代謝中可能具有重要功能［1，6－7］。本研究將以大腸桿菌為宿主菌，制備重組hCTRP6蛋白，在動物和細胞水平上分析能量代謝調(diào)節(jié)活性。

1　材料

表達菌株BL21-codonplus（DE3）、表達載體pET32a（＋）購自Invitrogen公司。鎳親和層析樹脂購自Qiagen公司，分子篩Sephadex G-75購自于GE公司，p-AMPKα、AMPKα及β-actin抗體購自CST公司（Cell Signaling Technology，Inc）。8周齡的C57BL／6♂小鼠由中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院實驗動物中心飼養(yǎng)。各種工具酶為TaKa-Ra公司產(chǎn)品，PCR引物由Invitrogen合成，一般化學試劑為Sigma分析純。

2　方法

2．1表達載體構建及表達產(chǎn)物的驗證 上游引物PF：5′-GCCCATGGCCTTTGACAGAGCTGTG-3′（CCA TGG NcoI位點）；下游引物PR：5′-CGCTCGAG-GTCGTCCTCGGCCTTGATG-3′（CTCGAG XhoI位點）；以從北京義翹神州生物技術有限公司（Sino Bi-ological Inc．）購買hCTRP6的cDNA為模板，PCR擴增目標片段、構建重組載體pET32／hCTRP6并轉化入大腸桿菌BL21-codonplus（DE3）菌株。隨機挑取5個轉化子單菌落，接種至20 mL含50 mg·L－1Amp LB液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，37℃、250 r ·min－1培養(yǎng)至A600＝0.6～0.8，加入終濃度0.1 mmol·L－1IPTG，20℃誘導5 h，取菌液2 mL，離心得菌體，向菌體中加入PBS溶液（1%曲拉通X-100、3 mmol·L－1PMSF）200 μL，超聲破碎，離心取上清，加入上樣緩沖液，熱變性后SDS-PAGE分析。

2．2重組蛋白純化 取過夜培養(yǎng)種子菌2 mL，接種至200 mL LB（含50 mg·L－1Amp）培養(yǎng)基中，37℃、250 r·min－1培養(yǎng)至A600＝0.6～0.8，于20℃誘導8 h，離心取菌體。鎳親合純化參照精編分子生物學實驗指南和文獻進行［8－12］。將鎳親合純化后的蛋白利用曲拉通X-114去除內(nèi)毒素并超濾濃縮，Superdex G-75分子篩進行純化，具體步驟參照文獻進行［8，12］。取不同咪唑濃度的蛋白洗脫液和經(jīng)分子篩純化收集的蛋白，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液、經(jīng)煮沸變性后，12%SDS-PAGE分析純化情況，純化蛋白利用兔抗His×6抗體蛋白印跡分析。Trx（硫氧還蛋白）的表達與純化參照文獻進行［8］。

2．3重組蛋白活性分析 小鼠肌管前體細胞C2C12分化為肌管細胞參照文獻進行［8］。分化細胞無血清DMEM饑餓12 h，加入終濃度為2 mg· L－1Trx-hCTRP6蛋白溫育不同時間，用含蛋白磷酸化酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解細胞，離心收集蛋白上清、BCA法測定濃度、12%SDS-PAGE分離蛋白、轉膜并利用相應抗體進行Western blot分析。

C57BL／6小鼠于中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院動物中心飼養(yǎng)，實驗操作嚴格按照動物委員會的相關規(guī)定開展。實驗小鼠在實驗前先測定其基礎血糖濃度；之后，按2 μg·g－1體重腹腔注射經(jīng)6 h饑餓的6周齡♂小鼠，腹腔注射9只，尾靜脈取血10 μL，測定注射后0、1、2、3、4、5及6 h的血糖濃度；同時，設注射Trx的對照實驗小鼠8只，腹腔注射與注射hCTRP6組等體積的Trx（2 μg·g－1體重）作為對照。

3　結果

3．1表達產(chǎn)物驗證 挑取pET32／hCTRP6重組載體的大腸桿菌BL21轉化子數(shù)個，于IPTG誘導前后分別提取可溶性總蛋白，蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結果如Fig 1所示。未經(jīng)IPTG誘導的轉化子（泳道5）在50 ku左右沒有特異表達產(chǎn)物，而4株經(jīng)IPTG誘導的BL21轉化子（泳道1－4）在50 ku左右有明顯的蛋白表達（箭頭所示），hCTRP6蛋白理論分子質(zhì)量約30 ku，其N-端融合了Trx片段（理論分子質(zhì)量約20 ku），hCTRP6全長蛋白與Trx融合蛋白的表達產(chǎn)物理論分子質(zhì)量大小約50 ku，該蛋白的分子質(zhì)量大小與預期分子質(zhì)量相符，說明實現(xiàn)了重組Trx-hCTRP6蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達。

Fig 1 SDS-PAGE identification of soluble expression of Trx-hCTRP6

3．2重組蛋白的純化 SDS-PAGE分析結果表明，含100、200及300 mmol·L－1咪唑的洗脫緩沖液能將目標蛋白從樹脂上洗脫，當咪唑為300 mmol· L－1時，目標蛋白的純度最高（Fig 2A）。純化結果說明，利用鎳親合層析可以對Trx-hCTRP6蛋白有效純化。將300 mmol·L－1咪唑洗脫的蛋白樣品收集，利用曲拉通X-114除去內(nèi)毒素后將蛋白于PBS中透析后超濾濃縮，Sephadex G-75分子篩對重組蛋白進一步純化，分子篩純化蛋白SDS-PAGE結果如Fig 2B所示，從Fig 2B可看出，經(jīng)分子篩后收集的樣品5和6純度最高，SDS-PAGE結果中看不到雜蛋白條帶。將收集的樣品5和6合并后超濾濃縮，分別取10和1 μg進行SDS-PAGE及Western blot分析，結果如Fig 2C所示，純化的樣品具有很高的純度，在目標位置的印跡條帶明顯。

3．3活性分析 純化的Trx-hCTRP6經(jīng)刺激C2C12分化肌管細胞。蛋白印跡分析信號轉導相關蛋白磷酸化變化情況，結果顯示，Trx-hCTRP6能激活AMPKα的磷酸化，Trx蛋白不能激活AMPKα的磷酸化。AMPKα的磷酸化結果如Fig 3A所示，經(jīng)2 mg·L－1的hCTRP6刺激10 min，AMPKα的磷酸化程度增加；當Trx-hCTRP6刺激超過20 min，AMPKα磷酸化的增加更趨于明顯。以上蛋白印跡結果表明，大腸桿菌表達的Trx-hCTRP6具有生物活性。

Fig 2 Purification of fusion recombinant protein of Trx-hCTRP6

降血糖活性測定結果表明：在注射前和注射重組蛋白1～2 h內(nèi)，兩組小鼠的血糖水平?jīng)]有明顯差異；在注射3～4 h內(nèi)，注射Trx-hCTRP6的實驗組小鼠的血糖要低于注射Trx的對照小鼠，兩者之間存在明顯差異；但注射4 h后，兩實驗組小鼠的血糖濃度間的差異消失（Fig 3B）。動物實驗結果進一步證明，利用大腸桿菌表達純化的Trx-hCTRP6具有生物活性。

4　討論

目前，已成功克隆到至少15個高度同源的脂聯(lián)素類似物，雖然CTRPs在結構上具有相似性，但是它們參與的生理過程存在明顯差異［1－5］。越來越多研究表明，CTRPs除參調(diào)節(jié)能量代謝外，在心血管疾病中也發(fā)揮重要生理功能。例如：CTRP9通過激活AMPK信號通路改善心肌缺血／再灌注損傷肥胖所致的脂肪細胞因子產(chǎn)生失衡是心血管疾病發(fā)病的一個重要原因；CTRP6在頸動脈球囊拉傷處高表達，過表達CTRP6進一步促進球囊拉傷處血管內(nèi)膜增生等。

Fig 3 Biological activity assays of purified fusion recombinant protein Trx-hCTRP6

本研究主要目的在于制備活性CTRP6重組蛋白。我們已經(jīng)制備了具有生物活性的CTRP1和 2全長及球狀功能區(qū)蛋白，與CTRP1和2重組蛋白相比較，Trx-hCTRP6有激活AMP磷酸化的作用，但在檢測動物水平的降血糖活性時，Trx-hCTRP6蛋白在注射3 h后呈現(xiàn)出降血糖活性，降血糖活性僅能維持至注射后4 h。之前表達的CTRP1和2或其球狀功能區(qū)，降血糖活性在注射1 h后與對照組有明顯差異，在注射2 h后差異更為明顯，并且其降血糖活性至少維持5 h以上［8－11］。因此，相比較CTRP1 和2，Trx-CTRP6的降血糖活性明顯低于它們，這也意味著不同CTRP之間的降血糖效應存在差異。總之，本研究為hCTRP6蛋白的可溶和活性表達找到了一種有效方法，為該蛋白的應用及機制研究奠定了基礎。

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Expression，purification and biological activities assay of human C1q and tumor necrosis factor related protein-6

LI Hong-bo1，2，GAO Xue-fei2，LI Na2，WU Dong-hai2
（1．Dept of Life Sciences，Huaihua College，Huaihua Hunan 418008，China；2．Guangzhou Institute of Biomedicine and Health，CAS，Guangzhou 510530，China）

Abstract：Aim To prepare soluble human C1q and tumor necrosis factor related protein-6 in Escherichia coli and analyze the bioactivity．Methods Recombi-nant plasmid was transformed into E．coli expression strain，and the recombinant protein Trx-hCTRP6 was expressed induced by IPTG and then purified．Results

Trx-hCTRP6 was expressed efficiently and purified using Ni-NTA affinity chromatography and Superdex G- 75 column．The purified Trx-hCTRP6 was shown to be active under in vivo and in vitro assay conditions．Con-clusion Active Trx-hCTRP6 is efficiently prepared from E．coli protein expression system．

Key words：C1q and tumor necrosis factor related pro-tein-6；Escherichia coli；recombinant protein；affinity purification；Western blot；gel filtration chromatogra-phy

作者簡介：李洪波（1980－），男，博士，副教授，研究方向：生物制藥及生物化學與分子生物學，通訊作者，E-mail：lihong-bo8007＠163．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81300655）；湖南省重點學科建設項目（No 2011042）；廣東省科技計劃項目（No 2013B051000090）

收稿日期：2015－03－12，修回日期：2015－04－14

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）08－1165－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．08．027