袁 芳，李艷青，滕 旭，3，周京京，郭 贊，王 昕，張自偉，張 翼

(1.河北醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，河北石家莊 050017;2.河北省中醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050011;3.河北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊 050017;4.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北石家莊 050030)

代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)包括肥胖、胰島素抵抗、血脂異常、血壓升高和葡萄糖耐受不良等在內(nèi)的一系列危險(xiǎn)因素。MS中的任何一個(gè)因素都可能引起心臟病變，而上述因素的聯(lián)合作用還可能進(jìn)一步增加風(fēng)險(xiǎn)［1］。MS能夠使冠心病的發(fā)病率增加2倍，死亡率增加3倍［2］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，MS能夠同時(shí)導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)和功能的惡化，最終發(fā)展成為心力衰竭。而包括心肌細(xì)胞凋亡在內(nèi)的心肌結(jié)構(gòu)病理性改變是導(dǎo)致心功能降低，并最終發(fā)展成為心力衰竭的重要病理機(jī)制［3］。因此，如何通過(guò)改善心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而治療MS患者心功能異常已成為重要的研究靶點(diǎn)和策略。

慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH)是指間斷性的模擬高海拔的低壓低氧，在兩次低壓低氧之間恢復(fù)常壓常氧［4］。我實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)CIHH具有明顯的心血管保護(hù)作用，改善心肌缺血/再灌注損傷導(dǎo)致的心功能降低和心律失常的發(fā)生。我們前期通過(guò)Langendorff心臟離體灌流實(shí)驗(yàn)證實(shí)，果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)的MS大鼠缺血后在再灌注過(guò)程中心功能明顯降低，而CIHH能夠明顯改善果糖喂養(yǎng)大鼠心功能的下降［5］。但是，CIHH對(duì)MS大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制目前仍不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谧C實(shí)CIHH能夠改善MS大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 MS模型制備和CIHH處理 ♂，體質(zhì)量250～300 g，Sprague-Dawley(SD)大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(control)、果糖(fructose，F(xiàn))組、CIHH 組、果糖 +CIHH(CIHH-F)組。需要果糖喂養(yǎng)的大鼠飲用質(zhì)量濃度為100 g·L－1的果糖，共喂養(yǎng)42 d。CIHH組大鼠每天8∶00 am置于低壓低氧艙內(nèi)，給予模擬海拔5 000 m(PO2=11.2 kPa)的處理，每天持續(xù)6 h，其余時(shí)間將大鼠置于飼養(yǎng)室內(nèi)(常壓常氧)，共給予42 d的間歇性低壓低氧處理。CIHH-F組大鼠同時(shí)進(jìn)行果糖喂養(yǎng)和CIHH處理。所有大鼠自由飲食，每天計(jì)算飲水量，每周稱(chēng)量體重1次。

1.2 血壓測(cè)量 使用鼠尾動(dòng)脈壓測(cè)量裝置(LE5001，pressure meter，Panlab)，每周測(cè)量清醒大鼠鼠尾動(dòng)脈收縮壓(systolic arterial pressure，SAP)1次。每只大鼠每次測(cè)量重復(fù)3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)滿42 d后，饑餓大鼠12 h，經(jīng)頸總動(dòng)脈插管測(cè)量大鼠的動(dòng)脈血壓。測(cè)量結(jié)束后處死大鼠，分別取血和心臟進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)監(jiān)測(cè)。

1.3 血漿生化指標(biāo)檢測(cè) 大鼠血液經(jīng)抗凝離心(3 000 r·min－1，15 min)后取上層血漿，用以檢測(cè)血漿葡萄糖(葡萄糖氧化法，北京科美東雅生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)、膽固醇(膽固醇酯酶法，山東3V生物工程有限公司產(chǎn)品)、甘油三酯(甘油三酯水解酶法，山東3V生物工程有限公司產(chǎn)品)和胰島素(ELISA，北京北方生物技術(shù)研究所產(chǎn)品)含量。

1.4 心肌組織HE染色和TUNEL染色 心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片(厚度6 μm)，HE染色后觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化。TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，操作依據(jù)TUNEL試劑盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 心肌組織caspase-3活性測(cè)定 取心肌組織約20 mg勻漿，Bradford法測(cè)定蛋白濃度，酶標(biāo)法檢測(cè)caspase-3活性(106U·g－1protein)。詳細(xì)操作按照caspase-3活性測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 心肌組織Western blot 取心肌組織約50 mg勻漿，提取總蛋白，Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax以及β-actin的蛋白表達(dá)。簡(jiǎn)要過(guò)程為:將提取的心肌組織蛋白進(jìn)行蛋白定量(Bradford法)后，十二烷基硫酸鈉－聚丙稀酰胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗4℃ 孵育過(guò)夜(兔抗Bcl-2和兔抗Bax購(gòu)自Santa Cruz公司;兔抗β-actin購(gòu)自GeneTex公司)，TBST清洗3次，二抗(購(gòu)自GeneTex公司)室溫孵育1 h，發(fā)光，掃描儀掃描膠片，保存圖片。應(yīng)用NIH image軟件對(duì)圖片中條帶進(jìn)行灰度測(cè)量，Bcl-2和Bax的相對(duì)表達(dá)量為其條帶灰度與β-actin條帶灰度之比。

2 結(jié)果

2.1 CIHH明顯改善果糖喂養(yǎng)大鼠的MS一般特征和心臟改變 與對(duì)照組大鼠相比，F(xiàn)組大鼠空腹血漿胰島素、胰島素C肽(C peptide，C-p)、葡萄糖、膽固醇和甘油三酯明顯升高(Fig 1，P＜0.05)。而CIHH-F組大鼠上述血漿生化指標(biāo)的異常明顯改善(Fig 1，P＜0.05)。CIHH組血漿生化指標(biāo)與對(duì)照組大鼠差異無(wú)顯著性(Fig 1，P＞0.05)。

Fig 1 Effect of CIHH on blood biochemicals in fructose-fed rats(±s，n=6)

F組大鼠較對(duì)照組大鼠收縮壓、體重指數(shù)、心重/體重和左室重/心重明顯升高。而CIHH-F組大鼠上述指標(biāo)明顯改善。與對(duì)照組大鼠相比，CIHH組大鼠上述指標(biāo)差異無(wú)顯著性(Tab 1)。

Tab 1 Effect of CIHH on body mass index，systolic arterial blood pressure and heart weight in fructose-fed rats(±s，n=6)

Tab 1 Effect of CIHH on body mass index，systolic arterial blood pressure and heart weight in fructose-fed rats(±s，n=6)

CIHH:Chronic intermittent hypobaric hypoxia treated group;Fructose:Fructose treated group;CIHH-F:CIHH and fructose treated group;HW/BW:Ratio of total heart weight to body weight;LVW/THW:Ratio of left ventricular weight plus inter-ventricular septum weight to total heart weight.*P ＜0.05 vs control rats;#P ＜0.05 vs fructose group.

Groups Body mass index/kg·m －2 SAP/kPa HW/BW/mg·g－1 LVW/HW/g·g －1 Control 6.3 ±0.02 15.5 ±0.64 4.32 ±0.15 0.78 ±0.01 Fructose 7.0 ±0.02* 20.4 ±0.90*4.77 ±0.13*0.85 ±0.02*CIHH 6.1 ±0.03#15.0 ±0.93#4.26 ±0.17#0.77 ±0.02#CIHH-F 6.3 ±0.02#15.2 ±1.13#4.35 ±0.18#0.79 ±0.02#

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和CIHH組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)明顯的變性、壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。F組大鼠心肌細(xì)胞水腫，排列紊亂，細(xì)胞之間間隙增寬，結(jié)締組織增多。而CIHH-F組大鼠心肌結(jié)構(gòu)損傷較F組大鼠明顯改善(Fig 2)。

Fig 2 Histological analysis of hearts of control，CIHH，fructosefed and CIHH-F groups(200×)(±s，n=6)

2.2 CIHH明顯改善果糖喂養(yǎng)大鼠的心肌細(xì)胞凋亡 TUNEL染色顯示，對(duì)照組和CIHH組大鼠僅見(jiàn)少量、散在的凋亡心肌細(xì)胞。F組大鼠凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而CIHH-F組大鼠凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量較F組大鼠明顯降低(Fig 3 A，B)。

caspase-3活性檢測(cè)同樣顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)組大鼠心肌caspase-3活性明顯升高。CIHH能夠明顯抑制果糖誘導(dǎo)的caspase-3活性升高。而單純CIHH組心肌caspase-3活性與對(duì)照組無(wú)差別(Fig 3C)。

Fig 3 Effect of CIHH on apoptosis in fructose-fed rats

2.3 CIHH可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2/Bax比值抑制心肌細(xì)胞凋亡 Western blot結(jié)構(gòu)顯示，與對(duì)照組大鼠相比，F(xiàn)組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2/Bax比值明顯降低。CIHH能夠明顯改善果糖喂養(yǎng)導(dǎo)致的上述蛋白的表達(dá)改變。而單純CIHH和對(duì)照組相比，上述蛋白表達(dá)和比值無(wú)明顯差異(Fig 4)。

Fig 4 Protein expression of Bcl-2 and Bax in myocardium detected by Western blot

3 討論

我們利用果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)的大鼠MS模型證實(shí)，CIHH能夠明顯改善MS大鼠的相關(guān)癥狀，包括高血壓、高血糖、血脂紊亂和胰島素抵抗等。而且，CIHH能夠明顯改善MS大鼠的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制線粒體途徑發(fā)揮改善心肌細(xì)胞凋亡的作用。上述結(jié)果可能為MS患者心肌損傷的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

由于富含果糖飲料的消費(fèi)增加，人們?nèi)粘z入的果糖量相應(yīng)增加。而越來(lái)越多的研究證實(shí)高果糖攝入量是促進(jìn)MS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。果糖喂養(yǎng)的大鼠能夠誘導(dǎo)出與人MS及其相似的病理生理改變，包括胰島素抵抗、體重增加、高脂血癥、高胰島素血癥、高甘油三脂血癥、葡萄糖耐量降低、高血壓、心功能異常和心力衰竭等［6］。本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用10%果糖水喂養(yǎng)大鼠42 d同樣成功誘導(dǎo)出MS的相應(yīng)表現(xiàn)，如高血壓、高血糖、高甘油三脂血癥、高膽固醇血癥和高胰島素血癥等。上述結(jié)果提示，通過(guò)果糖喂養(yǎng)制備大鼠MS模型是可行的，能夠成功誘導(dǎo)出MS的相關(guān)病理生理表現(xiàn)。

心肌損傷和心功能異常是MS的重要并發(fā)癥之一，并最終導(dǎo)致患者的死亡率增加［1］。肥胖飲食誘導(dǎo)的MS大鼠心功能明顯降低，電鏡觀察顯示心肌纖維排列紊亂、線粒體水腫，天狼星紅染色顯示間質(zhì)纖維化明顯增加［7］。高脂飲食+25%果糖水喂養(yǎng)的MS大鼠同樣表現(xiàn)出心功能的抑制，以及心肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原纖維沉積增加［8］。單純應(yīng)用高果糖飼料(50%果糖濃度)喂養(yǎng)的MS大鼠，心肌HE染色顯示心肌結(jié)構(gòu)紊亂、組織間隙明顯增寬，TUNEL染色顯示左室心肌凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加［3］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，10%果糖水喂養(yǎng)大鼠的心肌組織表現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)損傷，細(xì)胞水腫、排列紊亂、間隙增寬和結(jié)締組織增多，凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量明顯增加。而上述心肌組織的病理變化和細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致心功能降低的重要原因。

越來(lái)越多的研究顯示，CIHH具有明顯的心血管調(diào)節(jié)和保護(hù)作用。CIHH能夠明顯改善缺血誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞L型鈣電流峰值的降低［9］，抑制右心室乳頭肌β-腎上腺素能受體活性［10］，從而發(fā)揮心血管保護(hù)作用。此外，CIHH能夠明顯改善正常和MS大鼠缺血/再灌注誘導(dǎo)的心功能降低和細(xì)胞凋亡［5，11］。本實(shí)驗(yàn)中，我們進(jìn)一步證實(shí)，CIHH能夠明顯改善果糖喂養(yǎng)導(dǎo)致的的大鼠心肌細(xì)胞凋亡。CIHH改善心肌細(xì)胞凋亡的作用可能是其發(fā)揮心血管保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

線粒體途徑是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。Bcl-2家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡線粒體途徑的關(guān)鍵因子。根據(jù)功能，Bcl-2家族成員可分為兩類(lèi):一類(lèi)是細(xì)胞凋亡的抑制因子，例如Bcl-2、Bcl-Xl等;另一類(lèi)是細(xì)胞凋亡的促進(jìn)因子，例如Bax、Bak和Bad等。其中，Bcl-2和Bax及其比值是應(yīng)用最多的研究細(xì)胞凋亡的指標(biāo)。已有的研究發(fā)現(xiàn)，CIHH能夠改善缺血/再灌注導(dǎo)致的大鼠心肌Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)抑制Bax的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)抑制線粒體途徑改善心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕心肌缺血/再灌注損傷［11］。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)，果糖喂養(yǎng)的MS大鼠心肌組織Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax比值明顯降低，而CIHH能夠明顯改善上述指標(biāo)的變化。上述結(jié)果提示，CIHH可能通過(guò)抑制線粒體途徑改善心肌細(xì)胞的凋亡。

此外，其它的研究和本文都發(fā)現(xiàn)CIHH在改善異常的心功能和細(xì)胞凋亡時(shí)，對(duì)正常的心功能和細(xì)胞凋亡水平并沒(méi)有明顯的影響［5，11］。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CIHH的主要作用是維持體內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)態(tài)，而不是對(duì)某一生理功能或病理生理過(guò)程進(jìn)行單向的調(diào)節(jié)，即單純的增強(qiáng)或者減低某一功能或病理生理過(guò)程。而其具體的調(diào)節(jié)作用及詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)行深入細(xì)致的研究。

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