姚瓔珈，孔 亮，教亞男，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧大連 116600）

蛇床子素通過(guò)Wnt／β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)轉(zhuǎn)染APP基因的神經(jīng)干細(xì)胞分化為更多神經(jīng)元且減少神經(jīng)元凋亡

姚瓔珈，孔 亮，教亞男，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧大連 116600）

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R284．1；R322．8；R329．25；R341；R394.2；R745.702.6

摘要：目的 通過(guò)轉(zhuǎn)染APP基因于神經(jīng)干細(xì)胞，研究蛇床子素對(duì)其增殖和分化能力的影響，及對(duì)神經(jīng)元凋亡的影響，并研究其機(jī)制。方法 體外建立阿爾茨海默病的神經(jīng)干細(xì)胞模型，利用免疫組化染色法，研究蛇床子素對(duì)轉(zhuǎn)染APP基因的神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化能力的影響；通過(guò)CCK-8法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞存活率；Hoechst 33258法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況；RT-PCR法檢測(cè)GSK-3β和β-catenin mRNA的表達(dá)變化情況；Western blot法檢測(cè)GSK-3β和β-catenin蛋白的表達(dá)變化情況。結(jié)果 與APP組相比，蛇床子素組的神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力提高了10.24%；分化為神經(jīng)元的能力提高了6.74%。與APP組相比，蛇床子素組神經(jīng)干細(xì)胞的存活率明顯提高；神經(jīng)元凋亡明顯減少；RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，蛇床子素可抑制GSK-3β基因和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)β-catenin基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)論 蛇床子素可促進(jìn)轉(zhuǎn)染APP基因的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，可促進(jìn)其分化為更多的神經(jīng)元，并減少神經(jīng)元凋亡，可能與通過(guò)激活Wnt／β-catenin信號(hào)通路有關(guān)系。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默??；神經(jīng)干細(xì)胞；增殖；分化；神經(jīng)元；蛇床子素；Wnt／β-catenin信號(hào)通路

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．018．html

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是最常見(jiàn)的一種與年齡有關(guān)的癡呆病，AD主要的病理特征是β淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積，神經(jīng)元纖維的纏結(jié)（NFTs）和大量神經(jīng)元的丟失［1］。AD的病理特征為認(rèn)知功能退行性病變和記憶、學(xué)習(xí)能力的下降，且中老年人群中發(fā)病率較高［2－3］。神經(jīng)再生是一個(gè)由神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生新的神經(jīng)元的過(guò)程［4］，保持著神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化為神經(jīng)元功能之間的平衡，很多神經(jīng)退行性疾病正是因?yàn)榇斯δ芟陆祵?dǎo)致的。那么，提高大腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的存活和增殖能力，補(bǔ)充丟失的神經(jīng)元，將是一個(gè)非常有潛力的治療途徑。我們之前的研究已經(jīng)證明了蛇床子素（osthole，Ost）對(duì)正常狀態(tài)下的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化的影響，可減少Aβ孵育的神經(jīng)細(xì)胞中Aβ蛋白的表達(dá)［5］，這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？扇苄訟β寡聚體的沉積和神經(jīng)元的丟失是導(dǎo)致AD認(rèn)知功能障礙的主要致病因素［6］?，F(xiàn)有大量文獻(xiàn)證明，與AD發(fā)生有關(guān)的這些有毒性的Aβ是由Aβ前體樣蛋白（APP蛋白）通過(guò)β-分泌酶和γ-分泌酶水解而產(chǎn)生的［7］。體內(nèi)還存在與APP蛋白結(jié)構(gòu)相似的APLP1［8］和APLP2［9］蛋白。大量的文獻(xiàn)表明，AD的發(fā)生是與Wnt／β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)的Aβ產(chǎn)生神經(jīng)毒性有關(guān)［10］。

Wnt／β-catenin信號(hào)通路參與了細(xì)胞的增殖、分化、神經(jīng)元凋亡等，且在AD的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。Wnt信號(hào)通路存在兩種途徑：一種是經(jīng)典Wnt途徑，另一種是非經(jīng)典Wnt／PCP或者Wnt／Ca2＋途徑［11］。GSK-3β是一種高度保守的絲氨酸／蘇氨酸激酶，也是Wnt／β-catenin信號(hào)通路上重要的媒介，它對(duì)細(xì)胞蛋白的合成、增殖、分化和凋亡等均有影響。Toledo等［12］已經(jīng)通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯化鋰作為GSK-3β的抑制劑，激活Wnt信號(hào)通路，上調(diào)β-catenin表達(dá)水平，同時(shí)減輕AD模型APPswe／PSEN1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶障礙，減少Aβ聚集。Balaraman等［13］發(fā)現(xiàn)在AD患者腦內(nèi)，Wnt／β-catenin通路活性處于抑制狀態(tài)，導(dǎo)致GSK-3β表現(xiàn)出高活性。β-catenin為該信號(hào)通路上一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，它是GSK-3β下游靶點(diǎn)，在AD中明顯下降。它的丟失將破壞增殖、生長(zhǎng)，引起神經(jīng)元的死亡［14］。β-catenin代表著經(jīng)典Wnt／β-catenin信號(hào)通路，對(duì)神經(jīng)發(fā)生和發(fā)展有重要的作用［15］。因此，通過(guò)刺激內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的再生和增殖將是治療AD的一種有效的治療途徑。

蛇床子素（7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，ost-

hole，Ost）化學(xué)式：C15H16O3，分子質(zhì)量：244.38 u，是一種從多種中藥如蛇床子（Angelica pubescens Maxim．f．biserrata Shan et Yuan）中提取的天然香豆素，現(xiàn)如今確定的藥理作用包括抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用等［16－17］。我們之前的研究已經(jīng)證明，Ost能夠減輕神經(jīng)細(xì)胞由Aβ產(chǎn)生的神經(jīng)毒性［4］，又可提高以神經(jīng)干細(xì)胞為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)性的自身免疫性腦脊髓炎的治療效率［18］。

在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Ost對(duì)正常狀態(tài)下的神經(jīng)干細(xì)胞具有促進(jìn)其增殖和分化的作用，但是，Ost對(duì)由APP轉(zhuǎn)染產(chǎn)生Aβ的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化和遷移能力的報(bào)道卻少見(jiàn)。因此，我們想通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明Ost可提高轉(zhuǎn)染APP基因的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和存活能力，并促進(jìn)其分化為神經(jīng)元，減少神經(jīng)元凋亡，這將為Ost預(yù)防和治療AD提供新的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1試劑 Ost（批號(hào)：110822－200305，純度＞98%，244.39分子質(zhì)量；結(jié)構(gòu)見(jiàn)Fig 1）購(gòu)自于中國(guó)藥品檢驗(yàn)所（北京，中國(guó)）；DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、雙抗（100 kU·L－1青霉素＋100 mg·L－1鏈霉素）（美國(guó)Gibco公司）；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）（美國(guó)Peptide公司）；B27添加劑（B27）（美國(guó)Invitrogen公司）；DM-SO（美國(guó)Sigma公司）；LiCl（上海生工生物公司）；IWR-1-endo（美國(guó)Selleck公司）；CCK-8試劑盒（美國(guó)Dojindo公司）；大鼠抗巢蛋白（Nestin）抗體、兔抗干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白（SOX2）抗體（美國(guó)Millipore公司）；Cy3標(biāo)記驢抗兔IgG抗體（美國(guó)Jackson公司）；兔抗Ki67抗體、兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、兔抗少突膠質(zhì)細(xì)胞前體蛋白（NG2）抗體、兔抗神經(jīng)元核（NeuN）抗體（北京博奧森公司）；Hoechst 33258試劑（北京碧云天公司）；第一鏈cDNA合成（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）試劑盒和PCR引物擴(kuò)增（PCR Master Mix Kit）試劑盒（美國(guó)Thermo公司）；全蛋白提取試劑盒、Braford法檢測(cè)蛋白濃度試劑盒、蛋白緩沖液上樣試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

Fig 1 Chemical structure of osthole

1．1．2動(dòng)物 自然分娩48 h內(nèi)的小鼠（SPF級(jí)昆明種小鼠），體質(zhì)量2～3 g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（遼）2008－0002。

1．1．3儀器 倒置熒光生物顯微鏡（日本尼康公司）；超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：NU-4750E，美國(guó)Nuaire公司）；紫外－可見(jiàn)光分光光度計(jì)（型號(hào)：UV-5600，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：MR-96A，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；PCR儀（型號(hào)：MG96G，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；凝膠成像儀（型號(hào)：4100，上海天能科技有限公司）；水平核酸電泳儀（型號(hào)：PowerPac系列，美國(guó)Bio-Rad公司）。

1．2方法

1．2．1實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞隨機(jī)分為7組，每組3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。分別為：①GFP組；②APP組；③Ost組；④LiCl組；⑤APP＋LiCl組；⑥IWR-1-endo組；⑦IWR-1-endo＋Ost組。

1．2．2蛇床子素的配制 Ost溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，DMSO濃度最大比例不超過(guò)0．1%。用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）液稀釋成濃度為1 nmol· L－1Ost母液，并在－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?9］。本實(shí)驗(yàn)中APP組細(xì)胞經(jīng)過(guò)DMSO溶劑處理，且DMSO體積與給藥組的DMSO體積相等，即APP組為溶劑（DM-SO）對(duì)照組。

1．2．3神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng) 取新生2 d內(nèi)乳鼠的腦室下區(qū)（SVZ）和海馬區(qū)（hippocampus）［20］，然后將神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基內(nèi)，完全培養(yǎng)基包括1%B 27、20 μg·L－1bFGF、20 μg·L－1EGF和100 kU·L－1的雙抗。分離純化的神經(jīng)干細(xì)胞以1 ×109個(gè)·L－1的密度接種于24孔板，放在37℃、5%CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱內(nèi)開(kāi)始培養(yǎng)［21］。在3 d后半量換液，然后細(xì)胞開(kāi)始慢慢地懸浮成長(zhǎng)為神經(jīng)干細(xì)胞。

1．2．4APP基因轉(zhuǎn)染 第3代的神經(jīng)干細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，我們的實(shí)驗(yàn)要通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染1個(gè)與AD致病因素有關(guān)的APP質(zhì)粒［22］，此方法已經(jīng)成功用于IL-10轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞［23］和CCR5轉(zhuǎn)染骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞［24］。先將GFP和APP質(zhì)粒用試劑脂質(zhì)體2000來(lái)包裝293T細(xì)胞，在24 h后，熒光顯微鏡下觀察熒光情況。在36、72 h后收集上清病毒液，并將神經(jīng)干細(xì)胞打散為單個(gè)細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)染GFP和APP基因，在轉(zhuǎn)染3 d后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

1．2．5熒光免疫組化染色和Hoechst 33258染色96孔板培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在4℃，用4%多聚甲醛

固定30 min，然后用PBS液清洗，再用1%Triton室溫透化30min［25］。然后選擇相應(yīng)的一抗抗體：小鼠抗巢蛋白、兔抗星形膠質(zhì)細(xì)胞、兔抗少突膠質(zhì)細(xì)胞、小鼠抗神經(jīng)元和兔抗Ki67，用1%BSA溶解后4℃孵育過(guò)夜，次晨用相對(duì)應(yīng)的二抗孵育1 h后，用PBS液清洗3次。細(xì)胞核用4′6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色15 min。用免疫熒光顯微鏡計(jì)數(shù)每孔免疫熒光陽(yáng)性細(xì)胞。分化24 h后的細(xì)胞再用PBS液溶解Hoechst 33258染料，孵育30 min［26］，凋亡的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)的顆粒塊熒光［27］，從而確定凋亡細(xì)胞百分比，每孔實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．2．6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 神經(jīng)干細(xì)胞的存活率通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)［28］，打散的單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞以每孔5×107個(gè)·L－1細(xì)胞密度接種于96孔板，每組重復(fù)3孔。不同組別在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，再培養(yǎng)4 h。在450 nm波長(zhǎng)處，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，該吸光度的數(shù)值大小與神經(jīng)干細(xì)胞存活的數(shù)量密切相關(guān)。

1．2．7RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)情況 提取轉(zhuǎn)染了APP和GFP基因神經(jīng)干細(xì)胞的總RNA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)，加入1 mL TRIzol試劑，然后用第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。我們所用引物純度幾乎接近100%，所用引物序列為：APP-F（5′-GACTGACCACTCGACCAGCAGGTTCTG-3′），APP-R （5′-CTTGTAAGTTGGATTCTCATATCCG-3′）；GSK-3β-F（5′-CAACAGCCACCCCAAGAC-3′），GSK-3β-R （5′-GATCCCATCTGGTCATCC-3′）；β-catenin-F（5′-CCACTCCAGGAATGAAGG-3′），β-catenin-R（5′-AG-CAGTCTCATTCCAAGC-3′）；β-actin-F（5′-GG-GAAATCGTGCGTGACAT-3′），β-actin-R（5′-TCAG-GAGGAGCAATGATCTTG-3′）。使用PCR試劑盒進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)［5］。用Image J圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行吸光度掃描，結(jié)果用相對(duì)光密度表示，相對(duì)光密度＝光密度目的基因／光密度β-actin。

1．2．8免疫蛋白印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況神經(jīng)干細(xì)胞用預(yù)冷的PBS液清洗，然后加入蛋白抑制劑，根據(jù)總蛋白提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取總蛋白，然后通過(guò)Braford方法檢測(cè)總蛋白濃度［29］。每孔加入100 μg蛋白，用8%烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上［30］，用一抗抗體和適合的辣根酶標(biāo)記過(guò)的二抗抗體孵育，PVDF膜用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色試劑盒染色。用Image J圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行吸光度掃描，結(jié)果表示蛋白表達(dá)量變化情況。

1．2．9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析使用的是SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±方差表示，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都獨(dú)立重復(fù)至少3次。

2　結(jié)果

2．1轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞中APP和GFP的表達(dá) 我們從C57BL／6新生乳鼠的SVZ和海馬區(qū)分離提取神經(jīng)干細(xì)胞，在大約d 7，神經(jīng)干細(xì)胞增殖為半徑更大的神經(jīng)球。第3代典型的神經(jīng)球用免疫組化染色法染色，共同表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物Nestin（綠色）和Sox2（紅色），見(jiàn)Fig 2A。然后用APP和GFP慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖如Fig 2B。神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染APP基因的轉(zhuǎn)染率大概為85% （Fig 2C），大量表達(dá)APP基因和APP蛋白，見(jiàn)Fig 2D和2E。

2．2蛇床子素可促進(jìn)轉(zhuǎn)染APP基因的神經(jīng)干細(xì)胞增殖 Ost具有明顯的促進(jìn)神經(jīng)球形成的作用（Fig 3A）。我們將第5代神經(jīng)干細(xì)胞在d 1、4、8、12、15采用機(jī)械法將其打散為單個(gè)細(xì)胞，并在增殖培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線圖［19］。Fig 3B生長(zhǎng)曲線顯示Ost促進(jìn)轉(zhuǎn)染APP基因的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目的增多。在d 7，用Ki67染色法檢測(cè)其增殖能力［31］，見(jiàn)Fig 3C。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，APP組Ki67陽(yáng)性率明顯下降了24.80% （P＜0.01）；給藥組Ki67陽(yáng)性率比APP組明顯增強(qiáng)了10.24%（P＜0.05），見(jiàn)Fig 3D。

2．3蛇床子素可促進(jìn)轉(zhuǎn)染APP基因的神經(jīng)干細(xì)胞分化為更多的神經(jīng)元 為了證明Ost（100 μmol· L－1）對(duì)體外轉(zhuǎn)染APP質(zhì)粒的神經(jīng)干細(xì)胞分化能力的影響，我們將打散后的單個(gè)細(xì)胞放在分化培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。大約在12d后，通過(guò)免疫組化法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP＋）、神經(jīng)元（Ne-uN＋）和少突膠質(zhì)細(xì)胞（NG2＋）的情況［32］，見(jiàn)Fig 4A。根據(jù)定量分析后可得（Fig 4B），Ost作用后神經(jīng)干細(xì)胞分化為更少的星形膠質(zhì)細(xì)胞（APP組vs Ost組：62.67%±2.05%vs 54.27%±1.79%，P＜0．01）和更多的神經(jīng)元（APP組vs Ost組：19.53% ±2.25%vs 26.27%±3.19%，P＜0.05），但是對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)明顯影響（APP組vs Ost組：29.9%± 2.85%vs 28.2%±1.68%）。

Fig 2 Transduction of NSCs for APP and GFP expression

Fig 3 Osthole promotes APP transduced NSCs proliferation in vitro

2．4蛇床子素通過(guò)Wnt／β-catenin通路提高神經(jīng)干細(xì)胞存活率并且減少神經(jīng)元凋亡 為了驗(yàn)證Ost是否通過(guò)Wnt／β-catenin信號(hào)通路來(lái)提高神經(jīng)干細(xì)胞的存活率，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中用Wnt通路的抑制劑來(lái)阻斷通路信號(hào)和Wnt通路的激動(dòng)劑來(lái)激活信號(hào)。神經(jīng)干細(xì)胞用Ost（100 μmol·L－1）、IWR-1-endo

（Wnt信號(hào)通路抑制劑，10 μmol·L－1）和LiCl（20 mmol·L－1）作用后［33］，我們采用免疫熒光染色法檢測(cè)，繪制出凋亡細(xì)胞百分比，見(jiàn)Fig 5A和5B，結(jié)果顯示Ost作用后，降低了神經(jīng)元的凋亡。然后，再將細(xì)胞重新接種后的d 3采用CCK-8試劑孵育4 h，檢測(cè)細(xì)胞存活率。正如Fig 5C所示，LiCl組、Ost組、LiCl＋Ost組的細(xì)胞存活率與APP組相比有明顯升高（85.76%±4.02%、77.30%±3.41%、94.02%± 4.12%vs 69.03%±3.98%，P＜0.05，P＜0.01），IWR-1-endo組、IWR-1-endo＋Ost組的存活率與APP組相比有明顯下降（53.03%±3.19%、54.25% ±4.03%vs 69.03%±3.98%，P＜0.05），但是IWR-1-endo組和IWR-1-endo＋Ost組之間的細(xì)胞存活率差異無(wú)顯著性。

Fig 4 Osthole promotes differentiation into greater number of neurons

Fig 5 Osthole promotes the survival of transfected NSCs and reduces neuronal apoptosis

Fig 6 Effects of various treatment on the expression of GSK-3β，β-catenin mRNA and protein

2．5蛇床子素激活Wnt信號(hào)通路并抑制GSK-3β活性 Fig 6結(jié)果顯示，Ost能夠降低轉(zhuǎn)染APP質(zhì)粒的神經(jīng)干細(xì)胞中GSK-3β的mRNA表達(dá)，使β-cate-nin的mRNA表達(dá)升高。正如這樣的情況，LiCl作用后，β-catenin蛋白增多。當(dāng)用抑制劑IWR-1-endo作用后，GSK-3β mRNA及GSK-3β蛋白表達(dá)升高，但是與給藥組之間相比無(wú)明顯變化。

3　討論

AD是一種神經(jīng)退行性疾病，在工業(yè)大國(guó)約有2%的人口會(huì)得此病，并且這個(gè)數(shù)目在50年內(nèi)會(huì)翻兩倍［34］。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，我們知道與AD有關(guān)的Aβ是由APP蛋白水解產(chǎn)生的，而這些有毒性的Aβ寡聚體沉積與AD病人的認(rèn)知功能下降有密切關(guān)系［35］。Ost是一種天然香豆素類化合物，因?yàn)榫哂胁煌乃幚碜饔?，被認(rèn)為具有強(qiáng)大的治療潛能［36］。根據(jù)已知的Ost的藥理作用，例如抗炎［17］、抗氧化［37］和神經(jīng)保護(hù)作用［38］，還有我們之前實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Ost可促進(jìn)正常狀態(tài)下的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，那么，我們通過(guò)成功構(gòu)建一種模擬AD病理特點(diǎn)的體外AD細(xì)胞模型，來(lái)研究Ost對(duì)轉(zhuǎn)染APP的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化能力的影響。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)由APP產(chǎn)生的Aβ寡聚體會(huì)抑制神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。通過(guò)Ki67染色法發(fā)現(xiàn)，與APP組相比，Ost組的增殖能力明顯提高，并分化為更多神經(jīng)元，但兩組比較，分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力差異無(wú)顯著性。

為了探索Ost的作用機(jī)制，我們選取了Wnt／β-catenin信號(hào)通路上的激動(dòng)劑和抑制劑。利用NeuN 和Hoechst 33258染色，神經(jīng)元凋亡數(shù)目的結(jié)果說(shuō)明Ost具有抗神經(jīng)元凋亡的作用。再用CCK-8試劑盒檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的存活率，我們的結(jié)果顯示，Ost可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的存活率，但I(xiàn)WR-1-endo組和IWR-1-endo＋Ost組之間的細(xì)胞存活率差異無(wú)顯著性。為了進(jìn)一步了解Ost抗神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制，我們隨后利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了Wnt／β-cate-nin信號(hào)通路上的基因。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，在LiCl 或Ost作用后，GSK-3β的mRNA表達(dá)下降，而β-catenin的mRNA表達(dá)上升。我們又用Western blot技術(shù)檢測(cè)了GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)，Western blot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果是一致的。以上結(jié)果說(shuō)明

Ost是通過(guò)激活Wnt／β-catenin信號(hào)通路，抑制GSK-3β活性，并激活β-catenin活性，在體外發(fā)揮減少神經(jīng)元凋亡的作用。

一直以來(lái)，AD的發(fā)病機(jī)制尚未清楚，所以對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞用于AD潛在治療的研究已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他神經(jīng)退行性疾病。為了發(fā)現(xiàn)Ost是通過(guò)激活Wnt／β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和存活能力，提高向神經(jīng)元的分化能力，并且減少神經(jīng)元的凋亡，我們使用了Wnt／β-catenin信號(hào)通路的激動(dòng)劑和抑制劑，證明了Ost發(fā)揮藥理作用是與此通路有關(guān)。從所有結(jié)果來(lái)看，Ost將會(huì)是一種非常具有潛能用于治療AD或者其他神經(jīng)退行性疾病的藥物。

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Osthole promotes differentiation into neurons and reduces neuronal apoptosis via Wnt／β-catenin signaling pathway in APP transduced neural stem cells

YAO Ying-jia，KONG Liang，JIAO Ya-nan，LI Shao-heng，TAO Zhen-yu，YAN Yu-hui，YANG Jing-xian
（Dept of Pharmacology，School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian Liaoning 116600，China）

Abstract：Aim To investigate the effects of osthole （Ost）on the ability of proliferation and differentiation in APP transduced neural stem cells（NSCs），and neu-ronal apoptosis，in order to find related mechanism．Methods A model of Alzheimer′s disease（AD）cells was successfully established by transducing APP gene into NSCs in vitro．The ability of proliferation and dif-ferentiation was tested by staining．The viability of NSCs was determined by using CCK-8 assay．The cell apoptosis was tested by Hoechst 33258 staining．The expression of GSK-3β and β-catenin mRNA was deter-mined by RT-PCR．The expression of GSK-3β and β-catenin protein was determined by Western blot．Re-sults The ability of proliferation had increased by 10．24%with Ost treatment，compared with APP group． The ability of differentiation had increased by 6．74% with Ost treatment，compared with APP group．The vi-ability of NSCs had increased and cell apoptotic rate had decreased significantly．From the results of RT-PCR and Western blot，we could find the expression of GSK-3β mRNA and protein had decreased，and the ex-pression of β-catenin mRNA and protein had increased significantly，compared with APP group．Conclusion Ost could enhance the ability of proliferation and dif-ferentiation into more neurons of NSCs transducing APP gene，and reduce neuronal apoptosis．It might be relat-ed with activiting Wnt／β-catenin signaling pathway．

Key words：Alzheimer′s disease；neural stem cells；proliferation；differentiation；neurons；osthole；Wnt／β-catenin signaling pathway

作者簡(jiǎn)介：姚瓔珈（1990－），女，碩士生，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，E-mail：yaoyj23＠qq．com；楊靜嫻（1963－），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者，Tel：0411-87586009，E-mail：jingx-ianyang＠yahoo．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81173580）

收稿日期：2015－06－11，修回日期：2015－07－20

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）11－1516－08

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．009