范冬茹，張德巖，高智濤，王丹麗

(伊春林業(yè)科學院，黑龍江伊春153000)

4種東北食用菌內生菌的分離和純化

范冬茹，張德巖，高智濤，王丹麗

(伊春林業(yè)科學院，黑龍江伊春153000)

從黑木耳、猴頭菇、元蘑、榛蘑中分離內生菌，共得到內生真菌7株，內生細菌13株，其中革蘭氏陰性菌7株，革蘭氏陽性菌6株。猴頭菇未分離出內生菌。研磨法為最適分離方法。NB培養(yǎng)基上分離出的內生菌較多，而用來分離內生真菌的PDA培養(yǎng)基僅分離出2株內生真菌，表明其營養(yǎng)成分不適于內生真菌的生長。

食用菌；內生菌；研磨法

從植物中分離內生菌是獲得新的天然產物及開發(fā)新藥的潛在資源，對植物內生菌的研究，具有重大的意義和開發(fā)價值。近年來，從蔬菜、花卉、藥用植物等多種植物中分離到了大量內生菌，但在現有的報道中，對食用菌內生菌的研究較少。本實驗以元蘑、榛蘑、猴頭菇和伊春地區(qū)產量豐富的黑木耳為研究對象，分離和培養(yǎng)內生菌，開發(fā)新的微生物資源。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

黑木耳、猴頭菇采摘于烏馬河區(qū)為人工栽培種。元蘑、榛蘑采摘于紅星區(qū)為野生生長菌株。實驗對象要求為無霉爛、蟲蛀、新鮮的子實體，其中黑木耳應選取背部無筋脈的厚實耳片。

1.2 培養(yǎng)基

用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NB)分離、培養(yǎng)內生細菌；用葡萄糖馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)分離、培養(yǎng)內生真菌。培養(yǎng)基采用濕熱滅菌法滅菌，高壓蒸汽滅菌器121℃，維持20min。

1.3 方法

本實驗將子實體滅菌之后采用組織分離法、研磨法、印跡法3種方法分離內分菌。在內生菌分離過程中，同時設置超凈工作臺無菌狀態(tài)檢測、漂洗液檢驗法、組織印跡法3種對照處理，以確保準確分離食用菌內生菌。具體操作方法如下：

1.3.1 子實體滅菌。在內生菌分離之前，在超凈工作臺內不同位置放置5個敞開蓋子的PDA培養(yǎng)基，做超凈工作臺無菌狀態(tài)檢測。取新鮮的食用菌，無菌水沖洗5min，濾紙吸干表面水分后，用無菌水沖洗2次，75%乙醇浸泡3min，用無菌水沖洗3次，再用3%NaClO浸泡3min，用無菌水沖洗4次。將處理過的子實體壓入PDA培養(yǎng)基中，使子實體與PDA培養(yǎng)基接觸20min，移去子實體，做組織印跡法對照。把最后一遍漂洗子實體的無菌水，涂布于PDA培養(yǎng)基上，做漂洗液檢驗法對照。所有對照平板經28℃培養(yǎng)7天后，不得檢出任何雜菌。

1.3.2 內生菌分離

1.3.2.1 印跡法：用無菌解剖刀將滅菌后的食用菌表皮去掉，將內部組織切割成0.5cm的小塊，接于NB和PDA培養(yǎng)基上，并用鑷子稍稍用力按壓，然后將組織塊取出。

1.3.2.2 組織分離法：將取出的組織快接于NB和PDA培養(yǎng)基上。

1.3.3.3 研磨法：另取組織塊轉入研缽中，加入適量滅菌過的石英砂和無菌水進行研磨，靜止一段時間后，取上清液在NB和PDA上涂布。

每種方法3個平行。NB培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)24h，PDA培養(yǎng)基于28℃恒溫培養(yǎng)72h。純化，斜面保存菌種。

1.4 統(tǒng)計與鑒別

比較不同分離方法對食用菌內生菌的分離效果。觀察內生菌的菌落形態(tài)，通過革蘭氏染色對分離到的內生細菌形態(tài)進行觀察、鑒別。

2 結果與分析

2.1 不同分離方法對食用菌內生菌的分離情況

本實驗用3種方法對黑木耳、猴頭菇、元磨、榛蘑4種食用菌的內生菌進行分離。具體內生菌的分離數量見表1。

表1 不同分離方法對4種食用菌內生菌的分離結果

注：“-”表示未分離到食用菌內生菌

由表1可以看出，研磨法分離得到15株內生菌，組織分離法得到4株內生菌，印跡法分離得到1株內生菌，研磨法的分離效果最好。同時可以看出從榛蘑中分離出的內生菌數量最多，元磨、黑木耳次之。而猴頭中并未得到內生菌，可能因其子實體被菌刺覆蓋，消毒液沿菌刺進入子實體內部，而影響內生菌的分離。

2.2 不同培養(yǎng)基對食用菌內生菌的分離情況

NB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基分離內生細菌和內生真菌的情況見表2。

表2 不同培養(yǎng)基對4種食用菌內生菌的分離結果

由表2可以看出，NB培養(yǎng)基對內生菌的分離效果較好，分離出內生真菌5株，內生細菌9株。PDA培養(yǎng)基分離得到2株內生真菌，4株內生細菌。本次實驗中共分離得到7株內生真菌，13株內

生細菌。

2.3 內生細菌的菌落特征及細胞形態(tài)

本次實驗對內生細菌的菌落特征進行描述，并通過革蘭氏染色在顯微鏡下進行觀察，詳見表3。

表3 內生細菌菌落特征和細胞形態(tài)

3 結論

植物內生菌能產生許多生物活性物質，往往具有抑制病原菌、協(xié)助宿主抵抗病原菌和促進宿主植物生長的作用。本實驗對黑木耳、猴頭菇、元蘑、榛蘑的內生菌進行初步分離，共得到內生真菌7株，內生細菌13株，其中革蘭氏陰性菌7株，革蘭氏陽性菌6株。猴頭菇未分離出內生菌，可能是培養(yǎng)基不適或消毒液濃度過高的原因。3種分離內生菌的方法中，研磨法能使內生菌最大可能地釋放出來，分離出的內生菌數量最多，為最適分離方法。NB培養(yǎng)基上分離出的內生菌較多，而用來分離內生真菌的PDA培養(yǎng)基僅分離出2株內生真菌，可能是其營養(yǎng)成分不適于內生真菌的生長。

內生細菌菌數顯微鏡下觀察圖

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2015-08-03

范冬茹(1987-)，女，助理工程師，主要從事食用菌研究工作，E-mail:124950629@qq.com。

S759.81

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.05.013