孟順利，張力，史兆國，韓大勇，劉海霞，趙連娣，王美娟

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州　225300)

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綠色木霉、紅芝、酵母三菌混合發(fā)酵稻草秸稈生產(chǎn)蛋白飼料條件的研究

孟順利1，張力2，史兆國1，韓大勇2，劉海霞2，趙連娣1，王美娟2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州225300)

摘要：試驗首先研究了綠色木霉、紅芝共同發(fā)酵對秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解的影響，然后進行了二次發(fā)酵接種酵母生產(chǎn)蛋白飼料條件的研究.結(jié)果表明:綠色木霉、紅芝接種比例為1∶4、接種量為35%、共同發(fā)酵時間8 d、二次發(fā)酵時,酵母接種量7%、發(fā)酵時間為24 h時培養(yǎng)基的真蛋白含量最高.

關(guān)鍵詞：綠色木霉；紅芝；酵母；降解率；蛋白飼料

第一作者：孟順利(1988-)，男，碩士研究生，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學(xué).E-mail：719957159@qq.com

Study on conditions for protein feed production by mixed

我國作為一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物的秸稈資源非常豐富，在飼料中的應(yīng)用前景極為廣闊[1]，但是因為秸稈中含有大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素導(dǎo)致其直接利用價值很有限，據(jù)統(tǒng)計全世界每年產(chǎn)生大約20億t各種秸稈[2]，而其中只有一小部分被用于飼喂家畜，大約2/3被焚燒和浪費，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染.所以能否充分地對秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素進行降解是提升其利用價值的關(guān)鍵.目前減少秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的主要方法就是通過微生物發(fā)酵方法，綠色木霉是降解秸稈中的纖維素效果比較好的菌種之一.而秸稈中木質(zhì)素與半纖維素以共價鍵的形式結(jié)合，把纖維素分子包埋在其中，形成一種屏障，使纖維素酶不容易與纖維素分子接觸，木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、非水溶性導(dǎo)致了秸稈的難降解性[3].所以要想徹底降解纖維素，首先要解決木質(zhì)素的降解問題.白腐真菌能夠很好地降解木質(zhì)素[4]，紅芝屬于白腐真菌，對木質(zhì)素也有很強的降解能力，因此選擇綠色木霉和紅芝二菌共同培養(yǎng)能夠提高秸稈的降解率.韋麗敏[5]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉和白腐真菌在瓊脂培養(yǎng)基上能夠共生，沒有拮抗作用，而綠色木霉的生長速度快于白腐真菌，在采用二次發(fā)酵方法發(fā)酵秸稈時發(fā)現(xiàn)秸稈中的木質(zhì)素降解率達到49.06%，纖維素的降解率提高了11.24%.何桂霞[6]研究發(fā)現(xiàn)綠色木霉和白腐真菌共同發(fā)酵秸稈其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率分別達到41.6%、36.35%和51.9%.

綠色木霉在降解纖維素的過程中會產(chǎn)生纖維二糖，纖維二糖可以產(chǎn)生競爭性反饋抑制作用，即纖維二糖與能分解長鏈纖維的外切葡聚糖酶的活性中心結(jié)合，從而使長鏈纖維很難再與外切葡聚糖酶結(jié)合，最終影響了秸稈中纖維素的降解率，不過這種抑制是可逆的.如果加入足夠量的β-葡萄糖苷酶或者引入可以利用纖維二糖的微生物消耗掉纖維二糖，則秸稈的纖維素降解率可以提高[7].產(chǎn)朊假絲酵母則可以快速地吸收和利用掉纖維二糖，酵母本身也可以進行快速地繁殖生長，從而轉(zhuǎn)化成單細(xì)胞蛋白.李亞蕾等[8]利用綠色木霉和酵母發(fā)酵玉米秸稈生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料，秸稈中纖維素的降解率和蛋白含量都有所提高.廖雪義等[9]利用木霉和酵母混合發(fā)酵秸稈生產(chǎn)蛋白飼料中，其發(fā)酵終產(chǎn)物中粗蛋白含量從4.2%提高到19.7%，粗纖維含量從36.2%下降到24.1%.陶蕾等[10]利用復(fù)合菌劑發(fā)酵玉米秸稈發(fā)現(xiàn)秸稈中的纖維素下降了9.31%、粗蛋白含量增加了3.64%，奶牛頭均產(chǎn)量提高了48.6 kg.所以利用微生物的環(huán)境適應(yīng)能力強、操作簡單、成本低、發(fā)酵效率高等特點[11]，首先用綠色木霉和白腐真菌對秸稈進行發(fā)酵，降解其中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，然后對秸稈進行二次發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料，不僅可以降低處理秸稈的成本，還可以增加秸稈的利用價值，具有很大的可行性.

目前研究較多的是霉菌和酵母對秸稈進行發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料[12-13]，而白腐真菌和酵母的研究較少[14].鑒于此，本研究先對綠色木霉、紅芝降解稻草秸稈中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的條件進行初步研究，然后進行正交試驗得出能夠降解秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的最優(yōu)方案，再進行二次發(fā)酵接種酵母的單因素試驗及正交試驗，最終得出適合于發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的最終方案.

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種綠色木霉X-57、紅芝(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)實驗室保存)，熱帶產(chǎn)朊假絲酵母(廣東微生物菌種中心提供，江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)實驗室保存).

1.1.2培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：稱取去皮新鮮土豆200 g，切成小塊，加水至1 L，煮沸30 min.用紗布過濾后加20 g葡萄糖、20 g瓊脂粉，在電爐上加熱至瓊脂溶化，加水補足1 L[15].分裝至已空消過的試管中，置滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min.傾斜靜置，待凝固后備用.

綠色木霉液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，硫酸銨2.5 g，磷酸二氫鉀6 g，氯化鈣1 g，七水硫酸鎂0.8 g，碳酸鈣0.4 g，加水溶解定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至4.8.分裝入250 mL三角瓶中，裝液量為50 mL/瓶.121 ℃滅菌30 min.

紅芝液體種子液培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，紗布過濾,加入20 g蔗糖，融化后補水至1 000 mL，自然pH值，加入10 g秸稈粉，100 mL分裝250 mL三角瓶，121 ℃間歇滅菌[5].

YPD酵母菌種子液培養(yǎng)基：蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母膏1%，水95%.115 ℃滅菌30 min[16].

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草粉400 g：麩皮100 g，溶于1 L水，自然pH值，硫酸銨10 g，磷酸二氫鉀2.5 g，碳酸鈣2.5 g，七水硫酸鎂1.25 g，氯化鈷0.5 g，充分?jǐn)嚢?，分裝到250 mL三角瓶中，每瓶裝25 g，121 ℃滅菌60 min.

1.1.3溶液配制中性洗滌劑：稱取18.6 g乙二胺四乙酸二鈉和6.8 g四硼酸鈉，放入燒杯加少量水加熱溶解后，再加入30 g十二烷基硫酸鈉和10 mL乙二醇乙醚，再稱取4.56 g無水磷酸氫二鈉，放入另一個燒杯，加入少量的蒸餾水，加熱溶解后倒入上一個燒杯，定容到1 000 mL.

酸性洗滌劑：將20 g十六烷基三甲基溴化銨溶于標(biāo)定過的1 000 mL 0.5 mol/L硫酸溶液中充分?jǐn)嚢鑋17].

1.1.4主要儀器和設(shè)備高壓滅菌器(上海博迅實業(yè)有限公司，YXQ-LS-50SⅡ)；生化培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司，SHP-160)；數(shù)顯恒溫振蕩器(上海梅香儀器有限公司，THZ-82A).

1.2試驗方法

1.2.1菌種的活化將保存的菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)7 d，再轉(zhuǎn)接，一般轉(zhuǎn)接活化2～3次，于4 ℃保存?zhèn)溆肹15].

1.2.2種子液的制備用接種環(huán)接種一環(huán)綠色木霉和紅芝分別接種在綠色木霉和紅芝液體種子培養(yǎng)基里面，在28 ℃分別培養(yǎng)3 d和5 d.

接種一環(huán)假絲酵母與YPD酵母菌種子液培養(yǎng)基里并與28 ℃培養(yǎng)20 h.

1.2.3固體發(fā)酵將發(fā)酵好的種子液分別接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基在28 ℃進行培養(yǎng).

1.2.4單因素接種綠色木霉和紅芝的試驗

1.2.4.1綠色木霉和紅芝接種比例對稻草纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率的影響其他條件不變，按照綠色木霉∶紅芝為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6分別接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為20%，在28 ℃下培養(yǎng)6 d時測定其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率.本試驗共有5個處理，每個處理有3個重復(fù).

1.2.4.2綠色木霉和紅芝接種量對稻草纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率的影響其他條件不變，按照綠色木霉∶紅芝為1∶4的比例，總接種量分別為15%、20%、25%、30%、35%的比例接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 ℃下培養(yǎng)6 d時測定其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率.本試驗共5個處理，每個處理3個重復(fù).

1.2.4.3綠色木霉和紅芝共同培養(yǎng)時間對稻草纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率的影響其他條件不變，按照綠色木霉∶紅芝為1∶4的比例，總接種量為20%的比例接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃下培養(yǎng)，在培養(yǎng)2、4、6、8、10 d時測定其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率.本試驗共有5個處理，每個處理有3個重復(fù).

1.2.5多因素正交試驗結(jié)合單因素影響試驗結(jié)果，選取其中對纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率影響較大的因素，即接種比例為1∶3、1∶4、1∶5，發(fā)酵時間為4、6、8 d，接種量為20%、25%、30%，進行多因素共同作用下的L9(33)優(yōu)化組合正交試驗，對不同因素水平組合條件下的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率進行測定.試驗共9個處理，每處理3個重復(fù).

表1　共同培養(yǎng)正交試驗水平設(shè)計

1.2.6單因素接種酵母試驗

1.2.6.1酵母接種時間對固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響在綠色木霉和紅芝發(fā)酵最優(yōu)組合的基礎(chǔ)上，其他條件不變，在發(fā)酵2、4 、6、8、10 d時分別接種假絲酵母，酵母接種量(培養(yǎng)基：酵母的質(zhì)量體積比)為3%，在發(fā)酵24 h時測定培養(yǎng)基的真蛋白含量.本試驗共5個處理，每個處理3個重復(fù).

1.2.6.2酵母接種量對固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響在綠色木霉和紅芝發(fā)酵最優(yōu)組合的基礎(chǔ)上，其他條件不變，在固體培養(yǎng)基發(fā)酵6 d的時候以酵母接種量為1%、3%、5%、7%、9%的比例分別接種到培養(yǎng)基，在發(fā)酵24 h時測定培養(yǎng)基的真蛋白含量.本試驗共5個處理，每個處理3個重復(fù).

1.2.6.3酵母接種后發(fā)酵時間對固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響在綠色木霉和紅芝發(fā)酵最優(yōu)組合的基礎(chǔ)上，其他條件不變，在固體培養(yǎng)基發(fā)酵6 d的時候接種3%的假絲酵母，在發(fā)酵12、24、36、48、60 h時測定培養(yǎng)基的真蛋白含量.本試驗共5個處理，每個處理3個重復(fù).

1.2.7多因素正交試驗結(jié)合單因素影響的試驗結(jié)果，選取其中對發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量影響較大的因素，接種時間為4、6、8 d，接種量為3%、5%、7%，發(fā)酵時間為24、36、48 h，進行多因素共同作用下的L9(33)優(yōu)化組合正交試驗，對不同因素水平組合條件下的真蛋白含量分別測定.本試驗共9個處理，每個處理3個重復(fù).

表2　接種酵母發(fā)酵正交試驗設(shè)計

1.2.8纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、真蛋白含量的測定將培養(yǎng)好的固體培養(yǎng)基進行80 ℃烘干，測定其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、真蛋白含量的含量，測定方法見張麗英主編[16]的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》.

1.3數(shù)據(jù)處理

采用軟件SPSS 19.0對單因素試驗的數(shù)據(jù)進行方差分析，對正交試驗的數(shù)據(jù)進行極差分析.

2結(jié)果與分析

2.1單因素接種綠色木霉、紅芝試驗結(jié)果

2.1.1綠色木霉和紅芝接種比例對稻草纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率的影響如表3所示，綠色木霉、紅芝在接種比例為1∶4時稻草秸稈的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率最高，分別為29.01%、27.70%、39.23%.纖維素降解率隨著綠色木霉、紅芝接種比例的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在接種比例為1∶4時與1∶2、1∶6差異顯著(P<0.05).半纖維素降解率在接種比例為1∶4時與1∶3、1∶5差異顯著(P<0.05)，與其他比例差異不顯著.木質(zhì)素降解率在接種比例為1∶4時與1∶5、1∶6差異顯著(P<0.05)，因此，綠色木霉、紅芝最適的接種比例為1∶4.

表3　不同接種比例對稻草纖維素、半纖維素和

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05).

2.1.2綠色木霉、紅芝接種量對稻草纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解率的影響結(jié)果如表4所示，纖維素降解率在接種量為25%時與其他接種量差異顯著(P<0.05)，纖維素的降解率最高是22.95%.半纖維素降解率在接種量為25%時與其他接種量差異顯著(P<0.05)，半纖維素的降解率最高是42.48%.木質(zhì)素的降解率在接種量為25%時與15%、30%、35%的接種量對秸稈的降解率差異顯著(P<0.05)，木質(zhì)素降解率最高為30.32%.因此在接種量為25%時秸稈的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率都是最高的.

表4　不同接種量對稻草纖維素、半纖維素和

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05).

2.1.3綠色木霉、紅芝共同培養(yǎng)時間對稻草纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解率的影響如表5所示，隨著培養(yǎng)時間的增加，秸稈的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率都逐漸的升高，當(dāng)培養(yǎng)6 d后纖維素和半纖維素的降解率組內(nèi)差異都不顯著(P>0.05)，降解率增長的速度也越來越慢.木質(zhì)素降解率在培養(yǎng)10 d時是最高，與其他培養(yǎng)時間差異顯著(P<0.05).但是升高速度減慢，考慮的培養(yǎng)時間的成本，選擇培養(yǎng)6 d為最合適.

表5　不同培養(yǎng)時間對稻草纖維素、半纖維素和

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05).

2.1.4多因素正交試驗結(jié)果比較各個因素水平均值，求出每個因素的最大平均值，可以得出培養(yǎng)基的最優(yōu)方案(表6).其最優(yōu)方案為A2B2C3，即接種比例1∶4，發(fā)酵時間6 d，接種量35%.通過分析，列出各個因素對指標(biāo)影響的大小.從表6中可以看出，對纖維素降解率的影響是RC>RA>RB，可以得出接種量對纖維素的降解率影響最大，然后是接種比例、培養(yǎng)時間；對半纖維素降解率影響是RB>RA>RC，即發(fā)酵時間影響最大，然后是接種比例、接種量；對木質(zhì)素降解率影響是RB>RC>RA，即培養(yǎng)時間影響最大，然后是接種量、接種比例.

表6　共同培養(yǎng)正交試驗結(jié)果

半降為半纖維素降解率，纖降為纖維素降解率，木降為木質(zhì)素降解率.

2.2單因素接種酵母試驗結(jié)果

2.2.1酵母接種時間對固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響由表7可知，隨著綠色木霉、紅芝培養(yǎng)時間的增加，分別在第2、4、6、8、10天接種酵母其真蛋白含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，最高是在第8天達到10.14%，而第10天出現(xiàn)降低，第2天最少與其他接種時間差異顯著(P<0.05)，其他接種時間之間差異不顯著(P>0.05).

2.2.2酵母接種量對固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響由表8可知，隨著接種量的增加，真蛋白含量也增加，而在接種量為5%以后再增加接種量時其真蛋白含量基本持平差異不顯著(P>0.05)，所以以節(jié)約為準(zhǔn)則，應(yīng)選5%的接種量.

2.2.3酵母接種后發(fā)酵時間對固體發(fā)酵培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響從表9可知，隨著發(fā)酵時間的延長，在前36 h內(nèi)其真蛋白含量和發(fā)酵時間成正相關(guān)，之后基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，在48 h時達到最高.發(fā)酵12 h時與其他發(fā)酵時間差異顯著(P<0.05)，而在發(fā)酵24、36、48、60 h之間差異不顯著(P>0.05).

表7　不同接種時間對培養(yǎng)基中真蛋白含量的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05).

表8　不同接種量對真蛋白含量的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05).

表9　不同發(fā)酵時間對真蛋白含量的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母的表示差異顯著(P<0.05).

2.2.4多因素正交試驗結(jié)果從表10中可以看出，培養(yǎng)基的最優(yōu)方案為A3B3C1，即接種時間8 d，接種量7%，發(fā)酵時間24 h.通過分析，對真蛋白含量影響最大的是接種量，然后是接種時間、發(fā)酵時間.

表10　接種酵母正交試驗結(jié)果

3結(jié)論

本試驗通過對綠色木霉、紅芝、酵母共同發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究，進行了單因素試驗和多因素的正交試驗，綜合了規(guī)?；囵B(yǎng)及實際生產(chǎn)過程中的成本考慮，最終得出最優(yōu)方案為綠色木霉、紅芝接種比例為1∶4、接種量為35%、共同發(fā)酵時間8 d、二次發(fā)酵時酵母接種量7%、發(fā)酵時間為24 h時,培養(yǎng)基中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率最好，培養(yǎng)基中真蛋白含量最高，可以達到10%左右.由于試驗所用菌種是從外購買，其各種產(chǎn)酶活性及各種生理生化指標(biāo)試驗都需要進一步進行，這些工作有待于今后逐步研究.

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(責(zé)任編輯趙曉倩)

fermentation ofTrichodermaviride,ganoderma

and yeast for rice straw

MENG Shun-li1,ZHANG Li2,SHI Zhao-guo1,HAN Da-yong2，LIU Hai-xia2,

ZHAO Lian-di1,WANG Mei-juan2

(1.College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；

2.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300，China)

Abstract：The aim of the study was to optimize the conditions of fermentation by common fermentation ofTrichodermaviride,ganoderma and yeast.A combined fermentation was conducted firstly withT.virideand ganoderma to degrade cellulose，hemicellulose and lignose of straw. Then，the conditions of protein feed production was studied by inoculating yeast with secondary fermentation.When the inoculation proportion ofT.virideand ganoderma was 1∶4，inoculation 35%，fermentation 192 h，the inoculation of yeast 7%，fermentation 24 h .Under this condition，the content of real protein in culture medium reached the highest.

Key words：Trichodermaviride;ganoderma;yeast;degradation rate;protein feed

收稿日期：2014-10-17；修回日期：2014-11-18

通信作者：史兆國，男，教授，碩士生導(dǎo)師，從事家禽生產(chǎn)與家禽營養(yǎng)的研究.E-mail：shizhaoguo@gsau.edu.cn

中圖分類號：S 816

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2015)06-0006-06