李紅米 駱 萍 邱 楊 鐘曉鳴

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2013年6月至2015年6月江西省腫瘤醫(yī)院腹部外科胃癌及癌旁2 cm以外正常組織手術(shù)標本120例，均經(jīng)術(shù)后病理確診，其中男性71例，女性49例，年齡30～63歲，術(shù)前均未接受放化療及靶向治療。

1.1.2 試劑、設(shè)備和儀器 胃癌MNK45和SGC7901細胞由上海鼎晶生物醫(yī)藥科技有限公司提供、TaqMan miRNA分析試劑盒(博奧生物有限公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基(上海滬宇生物科技有限公司)、脂質(zhì)體Lipfectamine 2000(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)、反義miR-10b寡核苷酸(miR-10b ASO)(上海賓智生物科技有限公司)、胎牛血清(上海素爾生物科技有限公司)、總蛋白提取試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司)、TranswellChamber(美國Chemicon公司)、兔抗人RHOC單克隆抗體(上海瑞齊生物科技有限公司)、RT-PCR分析儀(美國ABI公司)、Matrigel膠(重慶市華雅干細胞技術(shù)有限公司)、β-actin二抗(武漢博士德生物工程公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 采用RT-PCR技術(shù)檢測miR-10b的表達情況提取胃癌組織及對應(yīng)癌旁2 cm以外正常組織中總RNA，然后使用miRNA試劑盒檢測胃癌組織及對應(yīng)癌旁2 cm以外正常組織中miR-10b的表達。取2 μg總RNA為反應(yīng)模板與3 μl逆轉(zhuǎn)錄酶相互混合，反應(yīng)結(jié)束之后收集cDNA。采用SYBR Green法定量檢測，將質(zhì)粒稀釋品梯度分別稀釋標準梯度，并用于建立標準曲線。在要求的反應(yīng)條件下，共完成45個循環(huán)，最后延伸7 min，且在每個循環(huán)的最后環(huán)節(jié)增加溶解曲線。依據(jù)標準曲線計算目的基因的mRNA量。實驗重復(fù)3次。

1.2.2 反義miR-10b單核苷酸序列設(shè)計 首先獲取人miR-10b的序列，然后設(shè)計出其反義寡核苷酸序列，并運用NCBI BLAST檢索程序排除其它同源序列。同時設(shè)計一條隨機陰性對照序列及隨機序列，并送上海鼎晶生物技術(shù)公司合成。

1.2.3 細胞培養(yǎng)和反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染 分別將MNK45和SGC7901胃癌細胞接種于胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。并運用Lipfectamine 2000試劑盒進行轉(zhuǎn)染，從而反義miR-10b寡核苷酸。轉(zhuǎn)染后再進一步培養(yǎng)，時間分別為24 h、48 h、72 h上述操作重復(fù)3次。

1.2.4 轉(zhuǎn)染miR-10b ASO后對miR-10b表達的影響轉(zhuǎn)染終濃度為150 nmol/L的miR-10b ASO 48 h后，提取總RNA，測定濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并測定濃度。運用microRNA檢測試劑盒檢測miR-10b的表達(具體條件同1.2.1)。上述操作重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell侵襲實驗 實驗前，先將不同分組的細胞換成無血清DMEM培養(yǎng)基。接種前，先將transwell小室復(fù)溫后加入DMEM培養(yǎng)液，然后孵育達到Matrigel水化。用胰酶消化成單懸，離心后收集洗滌，用DMEM培養(yǎng)基重懸細胞。吸出培養(yǎng)液，吸取500 μl DMEM于外室中作為趨化因子，加300 μl細胞懸液于內(nèi)室中，培養(yǎng)24 h。然后取出小室吸除培養(yǎng)基，去除未發(fā)生侵襲的細胞，將未穿過濾膜的細胞擦凈。然后將小室浸入細胞染色液中，再沖洗，最后風干。實驗中每組每次同時做3個重復(fù)小室，顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)每個視野中的細胞數(shù)，取平均值。

1.2.6 Transwell遷移實驗 具體過程同上，但實驗中不必鋪Matrigel。

再次，計算權(quán)向量并進行一致性檢驗。根據(jù)上述各個矩陣，通過根法對其權(quán)向量進行計算，以矩陣A為例來說明各單層次判斷矩陣權(quán)向量的計算方式：設(shè)A矩陣的權(quán)重向量為W，求判斷矩陣A每行的元素乘積，開3次方并進行歸一化處理，可得權(quán)重向量，根據(jù)公式（1）

1.2.7 劃痕實驗 取處于對數(shù)生長期的MNK45和SGC7901胃癌細胞，用Marker筆在6孔板背面均勻劃橫線，在孔中加入細胞，培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，過夜細胞需鋪滿整孔。然后采用10 μl槍頭劃痕，PBS洗去細胞碎片，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)。取樣時間為0 h和48 h，最后在熒光倒置顯微鏡下拍照。每個樣本至少重復(fù)3次。

1.2.8 檢測各組細胞中RHOC蛋白表達 收集各組MNK45和SGC7901細胞，運用總蛋白提取試劑盒提取各組細胞中的總蛋白，經(jīng)蛋白電泳轉(zhuǎn)膜、封閉后，再加一抗稀釋液稀釋兔抗人RHOC單克隆抗體，孵育過夜后緩沖液3次，再置于二抗稀釋液中孵育2 h，TBST緩沖液3次，運用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，胃癌組織及癌旁2 cm以外正常組織比較采用配對樣本t檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 采用RT-PCR技術(shù)檢測胃癌組織miR-10b的表達情況

如圖1所顯示:48.33%(58/120)的胃癌組織miR-10b的表達明顯高于癌旁2 cm以外正常組織19.17%(23/120)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值 =33.65，P＜0.05)。

圖1 胃癌組織及癌旁2 cm以外癌旁組織miR-10b表達的盒須圖

2.2 采用RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染miR-10b ASO后對miR-10b表達的影響

如圖2所顯示:MNK45細胞轉(zhuǎn)染組的miR-10b相對表達量較空白對照組和轉(zhuǎn)染隨機ASO組明顯降低(組間 F 值 =411.632，P ＜0.05);同樣發(fā)現(xiàn) SGC7901細胞轉(zhuǎn)染組的miR-10b相對表達量較空白對照組和轉(zhuǎn)染隨機組明顯下調(diào)(組間F值=506.16，P＜0.05)。

圖2 轉(zhuǎn)染miR-10b ASO后，MNK45和SGC7901細胞miR-10b的表達變化

2.3 Transwell實驗檢測抑制miR-10b的表達對胃癌細胞侵襲能力的影響

如圖3所顯示:MNK45細胞轉(zhuǎn)染組的侵襲能力與空白對照組及轉(zhuǎn)染隨機組相比明顯降低(組間F值=717.11，P ＜0.05)，而空白對照組與轉(zhuǎn)染隨機 ASO 組無明顯差異(P＞0.05)。如圖4所顯示:SGC7901細胞轉(zhuǎn)染組的侵襲能力較空白對照組、轉(zhuǎn)染隨機組相比明顯降低(組間 F 值 =696.81，P ＜0.05)，而空白對照組與轉(zhuǎn)染隨機ASO組無明顯差異(P＞0.05)。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-10b ASO后，MNK45細胞的侵襲能力明顯下降

圖4 轉(zhuǎn)染miR-10b ASO后，SGC7901細胞的侵襲能力明顯下降

2.4 Transwell實驗檢測抑制miR-10b的表達對胃癌細胞遷移能力的影響

如圖5所顯示:MNK45細胞轉(zhuǎn)染組的遷移能力與空白對照組及轉(zhuǎn)染隨機ASO組相比降低明顯(組間F值 =502.36，P ＜0.05)，而空白對照組與轉(zhuǎn)染隨機ASO組無明顯差別(P＞0.05)。如圖 6所顯示:SGC7901細胞轉(zhuǎn)染組遷移能力較空白對照組、轉(zhuǎn)染隨機ASO組相比降低明顯(組間 F值 =329.63，P＜0.05)，而空白對照組與轉(zhuǎn)染隨機ASO組無明顯差異(P ＞0.05)，見圖6。

圖5 轉(zhuǎn)染miR-10b ASO后，MNK45細胞的遷移能力明顯下降

圖6 轉(zhuǎn)染miR-10b ASO后，SGC7901細胞的遷移能力明顯下降

2.5 劃痕實驗檢測降低miR-10b基因表達對胃癌細胞遷移能力的影響

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-10b ASO組細胞劃痕的愈合率比空白對照組和轉(zhuǎn)染隨機ASO組細胞劃痕愈合率下降明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(MNK45細胞組間F值=689.96，P ＜0.05;SGC7901細胞組間 F 值 =602.63，P ＜0.05)。見圖7、8。

圖7 轉(zhuǎn)染miR-10b ASO后，MNK45細胞的劃痕愈合能力明顯下降

圖8 轉(zhuǎn)染miR-10b ASO后，SGC7901細胞的劃痕愈合能力明顯下降

2.6 運用 western blot檢查抑制 miR-10b的表達對RHOC蛋白表達的影響

Western blot檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn) miR-10b ASO組RHOC的相對表達水平較空白對照組和轉(zhuǎn)染隨機ASO組明顯降低(P ＜0.05)。見圖9、10。

圖9 RHOC蛋白在轉(zhuǎn)染miR-10b ASO的MNK45細胞中的表達

圖10 RHOC蛋白在轉(zhuǎn)染miR-10b ASO的SGC7901細胞中的表達

3 討論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤前三位。早期胃癌即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，這與胃癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力強密切相關(guān)，因此腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力是判斷胃癌預(yù)后的重要指標。miR-10b屬于miRNA家族中的一員，對腫瘤的診斷和治療具有一定的指導(dǎo)意義。近年來，關(guān)于miR-10b與多種惡性腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展及侵襲遷移關(guān)系的研究報道日漸增多，且研究證實微小RNA(miRNA)與胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移機制關(guān)系密切，目前已成為研究關(guān)注的熱點。

國內(nèi)已有研究結(jié)果顯示，胃癌組織中miR-10b的表達水平較癌旁組織升高，從而提示miR-10b在胃癌組織中的異常表達可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6］。本研究采用RT-PCR檢測了miR-10b在臨床胃癌標本及癌旁2 cm以外正常組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中miR-10b較癌旁2 cm以外正常組織呈明顯高表達，因此認為，miR-10b與胃癌的發(fā)生發(fā)展可能密切相關(guān)。

現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，miR-10b位于2號染色體短臂3區(qū)1帶1亞帶的HOXD4與HOXD8基因之間，尚未明確具體結(jié)構(gòu)，并且認為miR-10b與腫瘤細胞的侵襲遷移可能密切相關(guān)［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，HOXD10是miR-10b發(fā)揮促癌作用的靶點，miR-10b可與HOXD10部分互補結(jié)合，抑制HOXD10基因翻譯，最終導(dǎo)致腫瘤侵襲性增加［9］。國內(nèi)李量等［10］的研究證實，miR-10b在食管癌細胞轉(zhuǎn)移侵襲過程中發(fā)揮了重要作用。任輝等［11］采用transwell小室試驗發(fā)現(xiàn)抑制MNK45細胞內(nèi)miR-10b功能后，胃癌細胞侵襲能力顯著受阻，進而說明miR-10b在胃癌侵襲過程中發(fā)揮重要作用。本研究為了探究miR-10b對胃癌細胞侵襲遷移能力的影響，通過轉(zhuǎn)染miR-10b ASO達到抑制胃癌細胞中miR-10b的表達，而應(yīng)用transwell方法檢測，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-10b ASO的胃癌細胞侵襲遷移能力明顯降低。同時從劃痕實驗中也觀察到，在抑制miR-10b的表達后，胃癌細胞的劃痕愈合能力明顯降低。因此，本研究采用細胞劃痕愈合實驗和Transwell小室實驗證實了miR-10b可以促進胃癌細胞侵襲遷移能力。

目前已證實，RHOC(ras homology C)是小分子G蛋白超家族中的Rho亞族的蛋白之一，為侵襲相關(guān)蛋白，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。Clark等［12］應(yīng)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性瘤細胞中RHOC基因高表達，首次明確并證實RHOC在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中的作用，并提出RHOC與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究表明，RHOC蛋白可能是通過調(diào)控肌動蛋白細胞骨架，繼而調(diào)節(jié)細胞黏附和運動，進而作用于腫瘤侵襲遷移過程［13］為了進一步找出miR-10b的表達對胃癌細胞侵襲遷移的調(diào)控機制，本研究通過檢測miR-10b轉(zhuǎn)染組和對照組RHOC蛋白變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組較對照組明顯降低。同時我們發(fā)現(xiàn)抑制miR-10b的表達也顯著降低了RHOC蛋白的表達，因此我們認為:miR-10b可能是通過調(diào)控RHOC蛋白的表達從而對胃癌細胞的侵襲遷移產(chǎn)生影響。

因此，我們得出的結(jié)論是:miR-10b很可能通過與靶基因HOXD10部分互補結(jié)合，從而抑制HOXD10基因翻譯及抑癌蛋白的表達;通過提高RHOC蛋白的表達水平，從而增強了胃癌細胞的侵襲遷移能力。綜上所述，miR-10b在胃癌細胞的侵襲遷移過程中起了關(guān)鍵作用，并與當前的一些研究結(jié)果相一致，其很可能成為一個新的胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)基因。

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