鄒 榮，肖方喜，熊 飛，陳 芳，胡韜韜，黃曉麗，陳 菁，梁鴻卿

武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢 430022

慢性腎衰竭是各種慢性腎臟疾病發(fā)展的最終階段，腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同通路。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)過度表達(dá)在腎間質(zhì)纖維化過程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。經(jīng)典的TGFβ/Smad通路已經(jīng)在各種纖維化進(jìn)程中得到廣泛論述。但TGFβ也是一個作用廣泛的細(xì)胞因子，除了激活TGFβ/smad通路，還能夠活化其他重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如ERK、p38MAPK和PKA信號通路。抑制TGFβ1誘導(dǎo)PKA/CREB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能有效抑制胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)［1-2］。腎衰合劑是名中醫(yī)管竟環(huán)教授經(jīng)過長期臨床實(shí)踐總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方。針對腎衰合劑的臨床觀察和動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)腎衰合劑能有效緩解慢性腎衰竭的進(jìn)展［3-5］。但腎衰合劑治療慢性腎衰竭的分子機(jī)制仍不清楚。因此，我們擬建立慢性腎衰竭大鼠模型，觀察腎衰合劑對PKA信號通路和腎臟損害的影響，以探討腎衰合劑治療慢性腎衰竭的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組和處理 30只健康雄性SD大鼠［購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物中心，許可證號scxk(鄂)2011-0007］，體質(zhì)量180～200 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、動物模型組、中藥干預(yù)組；5/6腎臟切除建立慢性腎臟病模型。2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，俯臥固定，背部備皮、消毒，沿左肋脊角處切開皮膚，逐層暴露左側(cè)腎臟，剝除腎包膜，結(jié)扎上下極分別切除腎臟的1/3，1周后，沿右肋脊角處切開皮膚，完全摘除右側(cè)腎臟。假手術(shù)組僅行麻醉暴露雙腎，剝除腎包膜，不做手術(shù)切除。在手術(shù)1周后每天給予腎衰合劑［6］3 mL灌胃；手術(shù)后12周處死大鼠，生理鹽水將腎臟灌洗至發(fā)白，迅速摘取腎臟，部分殘腎固定于4%多聚甲醛以便制備石蠟切片，其余-80℃冰箱凍存，用于制備組織勻漿。

1.2 生化檢測 每周測血壓，采用自動生化分析儀檢測血肌酐(Scr)、尿素氮(Bun)、尿白蛋白(Alb)、尿蛋白/尿肌酐比值(UP/Ucr)等指標(biāo)。第12周時采用內(nèi)眥靜脈取血法采取靜脈血1 mL，代謝籠留取大鼠24小時尿液。采用BECKMAN自動生化儀測定Scr、Bun水平。BCA方法測定24小時尿蛋白含量。

1.3 腎臟病理學(xué)檢查 腎臟組織應(yīng)用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片3μm厚。腎組織常規(guī)處理后行HE染色，光鏡下觀察腎臟損害程度。依Rai j法對腎小球硬化程度進(jìn)行半定量分級，計(jì)算腎小球硬化面積指數(shù)(GSI)和腎小管間質(zhì)損傷評分(TIS)。

1.4 Western Blot檢測 col lagenⅣ、α平滑肌肌動蛋白(αSMA)、CREB、pCREB蛋白表達(dá)：稱取 100 mg新鮮冰凍組織加入1 mL蛋白裂解液(南京碧云天生物技術(shù)研究所)進(jìn)行勻漿，4℃12 000 r/min離心30分鐘，提取上清液。BCA法測定蛋白濃度。待測樣品按100μg/孔上樣，行10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉37℃封閉1小時，小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體(santacruz)、兔抗大鼠col lagenⅣ單克隆抗體(santa cruz)、兔抗大鼠CREB、pCREB單克隆抗體(cel l signal ing)4℃孵育過夜，洗膜后用HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG 37℃孵育1小時，ECL顯色成像。以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用圖像分析軟件對特異性條帶做吸光度(A)定量分析蛋白相對表達(dá)量。

1.5 Peptag非放射性蛋白激酶A檢測系統(tǒng)(promega)檢測PKA活化 取出冰凍大鼠腎皮質(zhì)組織，用預(yù)冷的勻漿器在5mL預(yù)冷的PKA ext raction buf fer中勻漿1 g腎組織，4℃15 000 rpm離心15分鐘，取上清液。按promega試劑盒操作手冊步驟檢測PKA活性。

1.6 各組取腎組織 常規(guī)冰凍切片，冷丙酮固定，滴加FITC熒光標(biāo)記抗大鼠IgG多抗(1∶50)，室溫孵育45分鐘后鏡檢并拍照。熒光強(qiáng)度表示：(-)無熒光；(±)高倍鏡下似乎可見；(+)低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下明顯可見；(++)低倍鏡下明顯可見，高倍鏡下清晰可見；(+++)低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼；(++++)低倍鏡下耀眼，高倍鏡下刺眼。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(χ±s)表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRF大鼠血生化指標(biāo) 治療過程中假手術(shù)組死亡1只，模型組死亡3只，中藥干預(yù)組死亡2只，共死亡6只。與假手術(shù)組比較，模型對照組24小時尿白蛋白、血尿素氮和血肌酐均顯著升高(P＜0.05)；與模型對照組比較，中藥干預(yù)組24小時尿白蛋白、尿素氮和血肌酐均顯著降低(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠血清肌酐、尿素氮，24小時尿蛋白檢測結(jié)果

2.2 5/6腎切除大鼠腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化 HE染色下，假手術(shù)組大鼠腎組織未見明顯病變，腎小球和腎小管大小、形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)未見明顯炎細(xì)胞浸潤。模型對照組腎皮質(zhì)變薄，腎小球系膜細(xì)胞明顯增生，硬化增多，部分腎小管明顯萎縮、消失，部分腎小球發(fā)生代償性肥大，腎小管發(fā)生代償性擴(kuò)張，部分可見蛋白管型，間質(zhì)纖維組織增生，大量淋巴細(xì)胞浸潤。與模型對照組相比，中藥干預(yù)組病變程度明顯減輕，腎小球硬化減少，腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化程度減輕，炎細(xì)胞浸潤減少(見圖1)。

圖1 光鏡下各組大鼠腎臟組織形態(tài)(HE染色，×200)

表2 腎小球硬化指數(shù)和腎小管間質(zhì)損傷

2.3 αSMA、col lagenⅣ膠原表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型對照組αSMA、col lagenⅣ蛋白水平均明顯升高(P＜0.05)；中藥干預(yù)組αSMA、col lagenⅣ蛋白水平明顯低于模型組(P＜0.05)。見圖2。免疫熒光檢測顯示模型組αSMA表達(dá)明顯增強(qiáng)，沉積于腎小球系膜區(qū)和少數(shù)毛細(xì)管袢，部分呈團(tuán)塊狀，熒光強(qiáng)度多為 (+++～++++)，腎衰合劑能抑制αSMA的表達(dá)，呈顆粒樣散在分布，強(qiáng)度為(+～++)。見圖 2。

圖2 Western Blot檢測col lagenⅣ、αSMA表達(dá)

2.4 腎皮質(zhì)PKA 與假手術(shù)組比較，模型組PKA被明顯激活，給予中藥干預(yù)后PKA活化狀態(tài)被明顯抑制，見圖3。

圖3 蛋白激酶A的檢測

2.5 皮質(zhì)蛋白pCREB的表達(dá) 假手術(shù)組、模型對照組、中藥干預(yù)組均有CREB蛋白表達(dá)，表達(dá)量3組無明顯差異；與假手術(shù)組相比，模型組pCREB表達(dá)明顯增加，與PKA活化表現(xiàn)一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；給予中藥干預(yù)后，pCREB表達(dá)量被明顯抑制，與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖4。

3 討論

慢性腎臟病(CKD)是一種嚴(yán)重危害人類健康的泌尿系統(tǒng)疾病，腎間質(zhì)纖維化是各種CKD發(fā)展到ESRD的共同途徑，其主要病理改變表現(xiàn)為腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生和胞外基質(zhì)蛋白過度積聚，是多種細(xì)胞、生長因子、細(xì)胞因子共同參與、相互作用，最終導(dǎo)致胞外基質(zhì)蛋白合成增多、降解減少，過度沉積的結(jié)果［7］。胞外基質(zhì)蛋白是由細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外周圍中的物質(zhì)，主要包括纖維成分、連接蛋白和填充分子等。正常的情況下，ECM的生成和降解保持動態(tài)平衡。腎臟局部缺血、缺氧及炎癥細(xì)胞浸潤時，多種生長因子持續(xù)表達(dá)導(dǎo)致腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生和ECM的沉積［8］。

慢性腎衰竭為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)病名，中醫(yī)學(xué)據(jù)其臨床演變過程將其分屬于關(guān)格、癃閉、水腫、虛勞等疾病范疇。本病的形成，存在虛、濁、瘀、毒四大病理機(jī)制，其中虛是主要病機(jī),且以腎虛為主，兼及肝、脾、肺。隨著病情進(jìn)展，由于陰損及陽或陽損及陰，以至出現(xiàn)氣陰兩虛及脾腎陽虛等證,在正虛的同時挾瘀濁毒等實(shí)邪，水濕內(nèi)蘊(yùn)體內(nèi)，日久化濁，濁腐成毒，毒滯成瘀，濕、濁、毒、瘀相互交結(jié)，蘊(yùn)結(jié)于內(nèi)，出現(xiàn)三焦阻遏，陰陽乖亂，氣血耗傷等諸多病理變化,并形成惡性循環(huán)［9-10］。

腎衰合劑是我院全國知名老中醫(yī)管競環(huán)教授治療慢性腎衰竭的臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要針對CRF正虛邪實(shí)病機(jī)的脾腎虛損，氣血不足而設(shè)，配以化濕祛瘀中藥。方藥組成以溫補(bǔ)脾腎、補(bǔ)益氣血藥為主，重在恢復(fù)中焦，使后天養(yǎng)先天，祛濁化瘀。方中黃芪、黨參健脾益氣；桑椹子、熟地黃滋補(bǔ)腎精以固腎元；白術(shù)、茯苓健脾化濕，以絕濁毒生化之源。諸藥合用共奏扶正祛邪，調(diào)和陰陽之功［6］。經(jīng)過10余年療效觀察，臨床大樣本觀察證實(shí)腎衰合劑能夠改善慢性腎衰竭患者脾腎陽虛癥狀，有效降低慢性腎衰竭患者體內(nèi)毒素水平，延緩腎功能惡化進(jìn)程[3]；腎衰合劑聯(lián)合蟲草菌粉能減輕腎小管損傷，保護(hù)殘余腎功能［4］；腎衰合劑配合灌腸治療CRF能改善腎功能，改善血液流變學(xué)異常，降低血管內(nèi)皮素ET-1水平［5］；動物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，中藥腎衰合劑可通過升高血PTH、降低降鈣素CT而糾正高鈣低磷狀態(tài)，達(dá)到治療慢性腎衰竭的目的［11］。

PKA是一類廣泛存在于真核細(xì)胞的蛋白激酶。經(jīng)典PKA通路可以表示為AC/c AMP/PKA/CREB。其全酶(hol oenzyme)為非活化的狀態(tài)，其蛋白分子是由兩個調(diào)節(jié)亞基(R)和兩個催化亞基(C)構(gòu)成的異四聚體。CRH與其I型受體結(jié)合后，通過G蛋白耦聯(lián)，激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸(c AMP)濃度增加，c AMP結(jié)合到PKA調(diào)節(jié)亞基，釋放出有活性的催化亞基。而有活性的催化亞基轉(zhuǎn)位進(jìn)入核內(nèi)，催化c AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的Ser l 33位點(diǎn)磷酸化以啟動下游基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞各種生理、病理改變［12-13］。我們在前期腎小球硬化的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，PKA信號通路在TGFβ誘導(dǎo)的腎小球硬化進(jìn)程中起到了重要的信號傳遞作用［14］。抑制PKA/CREB通路能直接阻斷TGFβ1誘導(dǎo)的腎小球硬化效應(yīng)。在本研究發(fā)現(xiàn)，5/6腎切除大鼠呈現(xiàn)PKA異?；罨癄顟B(tài)，給予腎衰合劑治療能明顯抑制大鼠腎皮質(zhì)PKA的活性，抑制CREB磷酸化，阻止系膜細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，減少胞外基質(zhì)蛋白沉積，從而抑制腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展。

本研究結(jié)果表明，腎衰合劑能改善慢性腎衰竭大鼠腎功能，降低 BUN、Scr，減少尿蛋白排泄。該腎臟保護(hù)效應(yīng)可能通過抑制PKA/CERB信號通路級聯(lián)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)。這為臨床上應(yīng)用中藥治療慢性腎衰竭提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但該方防治慢性腎衰竭的機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。

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