李亞男李春雨

（1.遼寧省風(fēng)沙地改良利用研究所,遼寧阜新 123000；2.阜新高等?？茖W(xué)校,遼寧阜新 123000）

利用抑制消減雜交技術(shù)鑒定綿羊肉質(zhì)性狀相關(guān)ESTs

李亞男1李春雨2*

（1.遼寧省風(fēng)沙地改良利用研究所,遼寧阜新 123000；2.阜新高等?？茖W(xué)校,遼寧阜新 123000）

肌肉品質(zhì)的遺傳改良是當(dāng)前畜禽育種的主要任務(wù)之一，本研究采用抑制消減雜交（SSH）技術(shù)構(gòu)建不同肉用綿羊品種（道賽特與小尾寒羊）以及雜交親代與子代（小尾寒羊與薩寒雜交羊）背最長肌的正反向消減cDNA文庫，并分離差異表達(dá)EST，進(jìn)行差異表達(dá)基因的全長cDNA與基因組DNA的克隆、時空表達(dá)分析，從而找到有價值的基因作為綿羊肉質(zhì)性狀的候選基因，并從基因表達(dá)水平上揭示不同肉用綿羊品種肉質(zhì)性狀差異和雜種優(yōu)勢的遺傳基礎(chǔ)，為綿羊基因組學(xué)的研究增加新的內(nèi)容，為綿羊肉質(zhì)性狀的分子標(biāo)記輔助選擇、優(yōu)質(zhì)肉羊新品種或品系培育提供科學(xué)依據(jù)，為雜種優(yōu)勢分子預(yù)測提供新途徑和方法。

1 主要內(nèi)容及研究方法

1.1 不同肉羊品種以及雜交親代與子代背最長肌的正反向消減cDNA文庫的構(gòu)建

本研究以遼寧省阜新市阜瑤牧業(yè)有限公司種羊場飼養(yǎng)的肉用綿羊?yàn)檠芯繉ο?，采用抑制消減雜交（SSH）技術(shù)構(gòu)建道賽特和小尾寒羊背最長肌的正反向消減cDNA文庫、小尾寒羊克和薩寒雜交羊背最長肌的正反向消減cDNA文庫。以管家基因B-actin作為消減指標(biāo)，對每個消減文庫的消減效率進(jìn)行檢測。

1.2 不同肉羊品種以及雜交親代與子代背最長肌的正反向消減cDNA文庫的篩選

采用PCR和斑點(diǎn)雜交的方法從構(gòu)建好的消減文庫中篩選陽性克隆。對鑒定為差異的克隆進(jìn)行測序，獲得的ESTs經(jīng)過去載體和拼接，與非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLASTx 比對分析。

根據(jù)所獲得的差異表達(dá)EST序列設(shè)計引物，采用RT-PCR方法對其差異表達(dá)的真實(shí)性進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，找出與肉質(zhì)性狀相關(guān)的基因。

1.3 差異基因全長克隆及序列分析

對所獲得的差異表達(dá)EST進(jìn)行電子延伸，再根據(jù)電子延伸所獲得的連續(xù)體或重疊群設(shè)計上游和下游引物。以SMART cDNA為模板，用下游引物和SMART 5’引物擴(kuò)增基因的5’端，用上游引

按照黨中央、國務(wù)院和云南省委、省政府關(guān)于生態(tài)文明建設(shè)和決戰(zhàn)脫貧攻堅(jiān)的決策部署，緊密聯(lián)系林業(yè)現(xiàn)代化建設(shè)和改革發(fā)展實(shí)際，圍繞增綠、增質(zhì)、增效和提供更多優(yōu)質(zhì)生態(tài)產(chǎn)品以滿足人民日益增長的優(yōu)美生態(tài)環(huán)境需要的目標(biāo)，云南省對林業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革和配套措施的探索，長期走在國內(nèi)前列。

物和SMART3’引物擴(kuò)增3’端，然后測序拼接，獲取基因的全長cDNA序列，并利用生物信息學(xué)方法對其特征進(jìn)行分析。

1.4 差異基因時空表達(dá)規(guī)律分析

差異基因的不同品種間表達(dá)分析：以管家基因β-actin作為對照，利用各差異基因特異引物分析差異基因在德國肉用美利奴、道賽特、薩?？?、小尾寒羊間的表達(dá)情況。

差異基因的不同發(fā)育階段表達(dá)分析：以管家基因β-actin作為對照，利用各差異基因特異引物分析差異基因在羊各發(fā)育階段（2、4、6、8、10、12月齡）的表達(dá)情況。

差異基因的不同組織表達(dá)分析：以管家基因β-actin作為對照，利用各差異基因特異引物分析差異基因在背最長肌、股二頭肌、半棘肌、脂肪、心、肝、脾、肺、腎、胰、小腸、胃、子宮、卵巢、睪丸等組織中的表達(dá)情況。

2 主要研究成果

2.1 構(gòu)建了2個肉用綿羊SSH 文庫

構(gòu)建了道賽特與小尾寒羊、薩寒雜交羊與小尾寒羊正反向消減cDNA文庫。對構(gòu)建的文庫進(jìn)行的差減效率檢測結(jié)果表明：看家基因β-actin在沒有消減組出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)是23，在消減組出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)是28，說明構(gòu)建的差異表達(dá)基因文庫的效率均是25倍，同時也表明所構(gòu)建的消減文庫中測試組和驅(qū)動組中共有的cDNA片斷被有效雜交，差異表達(dá)于肌肉組織中的基因得到有效的富集。

2.2 篩選出9個肉質(zhì)性狀相關(guān)候選基因ESTs

以 T7 和 SP6 通用引物進(jìn)行文庫篩選，結(jié)果顯示插入片段主要分布在 250～2000bp 之間，呈隨機(jī)分布，其中一部分克隆的 PCR電泳結(jié)果說明構(gòu)建的正反向差異表達(dá)基因的文庫質(zhì)量良好。對鑒定為差異的克隆進(jìn)行測序比對，差異表達(dá)驗(yàn)證和生物信息學(xué)分析，篩選出9個肉質(zhì)性狀相關(guān)的具有重要功能的候選基因ESTs，如表1所示。

表1 從SSH文庫篩選的肉質(zhì)性狀相關(guān)基因一覽表

2.3 獲得4個肉質(zhì)性狀相關(guān)差異基因全長cDNA序列

對所獲得的差異表達(dá)ESTs進(jìn)行電子延伸，設(shè)計引物，擴(kuò)增得到4條基因全長cDNA序列。對其特征分析表明其參與調(diào)控肌肉肌苷酸合成等生理過程，與綿羊肉質(zhì)風(fēng)味性狀緊密相關(guān)。

2.4 差異基因時空表達(dá)規(guī)律分析

利用克隆的4個基因特異引物分析差異基因在德國肉用美利奴、道賽特、薩?？恕⑿∥埠蜷g、在羊各發(fā)育階段和不同組織的表達(dá)情況，部分差異基因表達(dá)如圖所示。

圖1 ADSL基因在8種組織中的差異表達(dá)分布圖1-8分別為心、肝、脾、肺、腎、腦、腿肌和胸肌

3 研究成果的科學(xué)意義和應(yīng)用前景

本研究成果為研究肉用綿羊肉質(zhì)性狀提供了基因水平的基礎(chǔ)，能夠有效推動具有我國特殊肉質(zhì)性狀肉用綿羊的研究進(jìn)程，進(jìn)而加強(qiáng)具有我國獨(dú)特性狀的綿羊品種的開發(fā)與利用，創(chuàng)造出廣泛的社會及經(jīng)濟(jì)價值。

本課題所采用的理論和方法研究羊肉質(zhì)風(fēng)味性狀的相關(guān)基因，篩選和鑒定一批對肉質(zhì)性狀有重要作用的功能基因，應(yīng)用分子生物學(xué)、基因組學(xué)的理論與技術(shù)進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇來選種、育種，獲得更符合市場需求的優(yōu)良肉羊品種。一方面，項(xiàng)目中若干技術(shù)可以成為品種分子設(shè)計的基礎(chǔ)研究手段，提高我省肉用綿羊育種工作的原始創(chuàng)新能力，另一方面，本研究也為相關(guān)育種從經(jīng)驗(yàn)型向精確型轉(zhuǎn)變，使我省綿羊育種工作建立在分子遺傳學(xué)及相關(guān)學(xué)科先進(jìn)理論和技術(shù)的基礎(chǔ)上[2，3]，為提升綿羊育種的技術(shù)水平和育種效率奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

[1] 胡鵬飛，張貴學(xué)，于國慶，等.羔羊卵泡誘導(dǎo)發(fā)育、活體采卵和體外發(fā)育潛能研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011，42（2）：182-189.

[2] 胡鵬飛，李曉東，戴偉，等.不同水系絨螯蟹線粒體DNA 的遺傳差異和群體遺傳多樣性研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2008，23（3）：50-55.

李亞男（1980-），女，助理研究員，本科，研究方向?yàn)楂F醫(yī)臨床診療及畜牧生產(chǎn)技術(shù)。

李春雨（1981-），男，講師、國家執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，本科，研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)、高職畜牧獸醫(yī)專業(yè)教學(xué)改革。