劉書興 洪雅真 林曉鳳 李繼秋

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 原生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510631)

研究簡報(bào)

扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的分子克隆與序列分析

劉書興 洪雅真 林曉鳳 李繼秋

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 原生動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510631)

原生動(dòng)物是低等的真核生物, 具有個(gè)體微小, 結(jié)構(gòu)簡單, 繁殖迅速等生物學(xué)特征, 是一類復(fù)雜的、生理學(xué)功能高度集中的單細(xì)胞動(dòng)物[1]。原生動(dòng)物在地球上分布極廣,是微食物網(wǎng)的重要組成部分, 在自然界物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中具有樞紐作用, 因此具有重要的生態(tài)學(xué)功能和地位[2]。再者, 許多種類對(duì)棲息地環(huán)境變化十分敏感, 常作為環(huán)境指示生物用于水環(huán)境監(jiān)測(cè)中[3, 4]。因此開展原生動(dòng)物的生態(tài)學(xué)及其相關(guān)學(xué)科研究具有重要意義。

代謝酶活性及其基因表達(dá)水平作為重要的生物標(biāo)記物已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中[5, 6]。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase, EC 2.6.1.2)是一種以磷酸吡哆醛為輔酶的代謝酶, 其廣泛存在于有機(jī)體內(nèi), 通過催化丙氨酸和酮戊二酸與谷氨酸和丙酮酸之間的可逆反應(yīng)把生物體內(nèi)的糖代謝與氨基酸代謝相聯(lián)[7, 8], 因此丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶在糖異生、氨基酸代謝等細(xì)胞進(jìn)程中具有重要作用。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性常作為指示生物組織和細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)[9], 使其在生態(tài)毒理學(xué)中作為生物標(biāo)志物具有巨大的應(yīng)用前景。但是有關(guān)原生動(dòng)物丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性及其基因表達(dá)作為生物標(biāo)記物的研究尚未見報(bào)道。

開展相關(guān)酶的分子克隆與序列分析則是研究其應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。指示生物物種間生物標(biāo)記物的物種間差異一直是生物監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[10, 11]?；诖? 本研究擬對(duì)扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲ALT基因全長cDNA進(jìn)行克隆、序列分析、系統(tǒng)進(jìn)化等方面的研究, 旨在為扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲作為海洋水體的指示生物及其 ALT在生態(tài)毒理學(xué)研究提供前期的信息和資料。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用扇形游仆蟲(Euplotes vannus)和紅色偽角毛蟲(Pseudokeronopsis rubra)均采自大亞灣沿岸, 于華南師范大學(xué)原生動(dòng)物學(xué)研究室種庫 16℃、用滅菌海水在培養(yǎng)皿(D=9 cm)中并加以大米粒富集細(xì)菌單克隆培養(yǎng)保種。

總RNA極速抽提試劑盒(RNAfast200)購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司; RQ1 RNase-FreeDNase購自Promega公司; 瓊脂糖DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司, DH5α大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)購自廣州東勝生物科技有限公司, pMD18-T vector、Ex Taq DNA聚合酶、M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 RNA的提取與cDNA合成

采用孔徑為20 μm的篩絹初步富集處于對(duì)數(shù)生長期的扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲, 溶菌酶處理24h后, 滅菌海水沖洗, 離心(3000 r/m, 3min)富集得到的蟲體(細(xì)胞數(shù)＞2×105)用于提取總RNA。按照試劑盒說明書(RNAfast200)依次進(jìn)行裂解、去除雜質(zhì)和洗脫獲得總RNA。經(jīng)DNase消化, M-MLV RTase反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為供試材料。5′和3′RACE-Ready cDNA分別使用SMARTerTMRACE試劑盒中的5′-CDS Primer A和3′-CDS Primer A反轉(zhuǎn)錄合成。

1.3 纖毛蟲ALT全長cDNA的克隆

根據(jù) NCBI中已報(bào)道的原生生物的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶氨基酸序列, 進(jìn)行同源性比對(duì), 依據(jù)保守區(qū)域的氨基酸序列利用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)簡并引物 Akf和 Akr(表1)(由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。分別以扇形游仆蟲cDNA和紅色偽角毛蟲cDNA為模板, 使用設(shè)計(jì)的兼并引物擴(kuò)增扇形游仆蟲 ALT (EvALT)和紅色偽角毛蟲ALT (PrALT)的部分片段。依照瓊脂糖DNA純化回收試劑盒說明, 對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。參考pMD18-T Vector連接試劑盒中的說明書將目的基因連接到pMD18-T載體上, 并轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落進(jìn)行菌落 PCR檢測(cè), 同時(shí)進(jìn)行 LB液體培養(yǎng)基搖菌。選取經(jīng)PCR檢測(cè), 且產(chǎn)物條帶大小正確的單菌落對(duì)應(yīng)的菌液,送深圳華大基因科技有限公司測(cè)序鑒定。

經(jīng)NCBI BLAST分析檢測(cè)測(cè)序結(jié)果為所需的目的基因。在獲得EvALT和PrALT DNA片段基礎(chǔ)上, 設(shè)計(jì)特異性引物Ev-5′、Ev-3′和Pr-5′、Pr-3′(表1), 結(jié)合SMARTerTMRACE cDNA Amplification 試劑盒中的通用引物NUP(表1)進(jìn)行5′和3′RACE-PCR, 分別擴(kuò)增EvALT的5′、3′端序列和PrALT的5′、3′端序列。擴(kuò)增體系及循環(huán)參數(shù)根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行設(shè)置。PCR產(chǎn)物的回收、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序同前。測(cè)序結(jié)果在 NCBI上進(jìn)行比對(duì)分析, 確定為目的片段, 將5′端和3′端序列與目的基因片段序列進(jìn)行拼接,獲得EvALT cDNA全長和PrALT cDNA全長。

1.4 ALT氨基酸序列分析

在 GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基因序列相似性和同源性查找, 利用BioEdit軟件進(jìn)行同源性比對(duì)。全長序列的開放閱讀框(Open Read Frame, ORF)序列使用DNAstar軟件進(jìn)行分析。用DNAstar的EditSeq程序?qū)@得的ALT cDNA全長序列進(jìn)行翻譯, 獲得氨基酸序列后, 在NCBI protein blast上進(jìn)行檢測(cè)[12]。對(duì)該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對(duì)分子量利用在線程序Compute pI/Mw tool進(jìn)行評(píng)估, 蛋白質(zhì)的親/疏水性分析利用DNAstar的Protein工具[13], I-TASSER蛋白模型預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu), 應(yīng)用SignalP4.1和TMHMM2.0在線分析軟件預(yù)測(cè)該蛋白的信號(hào)肽[14], 判斷其是否屬于分泌蛋白以及形成跨膜結(jié)構(gòu)域等。

1.5 ML進(jìn)化樹的構(gòu)建

從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得19條ALT蛋白序列, 其中3條來自纖毛蟲原生動(dòng)物。利用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì), 并用Phyml軟件構(gòu)建ALT的最大似然樹。

2 結(jié)果

2.1 ALT基因全長cDNA序列的克隆和分析

扇形游仆蟲ALT序列特征 克隆得到扇形游仆蟲ALT的中間片段序列為255 bp, 5′端序列為433 bp, 3′端序列為713 bp且含有Poly A結(jié)構(gòu)及終止密碼子TAA。拼接后最終獲得長度為1231 bp的EvALT cDNA全長序列, 最大開放閱讀框?yàn)?095 bp, 編碼364個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量約為 40.95 kD, 等電點(diǎn)為 4.74, GenBank登錄號(hào)為KP100062。該氨基酸組成中帶正電荷氨基酸(K、R)33個(gè), 占9.07%, 帶負(fù)電荷氨基酸(D、E)51個(gè), 占14.01%, 整個(gè)蛋白帶負(fù)電荷, 疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)116 個(gè), 占31.87%, 極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)102個(gè), 占 28.02%。親/疏水性分析結(jié)果顯示: EvALT蛋白在23—68、98—115、205—230、301—329和 355—364區(qū)域?yàn)槭杷詤^(qū)域, 在1—19、82—99、138—160、230—260 和324—354區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)域。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該基因編碼的多肽鏈無信號(hào)肽, 不屬于分泌蛋白, 未形成跨膜結(jié)構(gòu)域。纖毛蟲屬于單細(xì)胞生物, 因此該蛋白為胞內(nèi)酶。

紅色偽角毛蟲ALT序列特征 克隆得到紅色偽角毛蟲ALT的中間片段序列為259 bp, 5′端序列為463 bp, 3′端序列為760 bp且含有Poly A結(jié)構(gòu)及終止密碼子TGA。拼接后最終獲得長度為1164 bp的PrALT cDNA全長序列,最大開放閱讀框?yàn)?077 bp, 編碼358個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量約為40.22 kD, 等電點(diǎn)為5.23, GeneBank登錄號(hào)為KP100063。該氨基酸組成中帶正電荷氨基酸(K、R)36個(gè), 占10.06%, 帶負(fù)電荷氨基酸(D、E)45個(gè), 占12.57%, 整個(gè)蛋白帶負(fù)電荷, 疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)105 個(gè), 占29.33%, 極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)101個(gè), 占28.21%。親/疏水性結(jié)果顯示: PrALT蛋白在15—23、36—50、128—138和 350—360區(qū)域?yàn)槭杷詤^(qū)域, 在1—15、75—110、145—180、230—275和322—353區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)域。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該基因編碼的多肽鏈無信號(hào)肽, 不屬于分泌蛋白, 未形成跨膜結(jié)構(gòu)域。

表1 本文研究所用引物及用途Tab. 1 Sequences of primers used in this study

2.2 ALT氨基酸序列比對(duì)分析和基因功能區(qū)域

將獲得的 EvALT編碼的氨基酸序列通過 BLAST P搜索 NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫, 發(fā)現(xiàn)該序列與三棱尖毛蟲(Oxytricha trifallax)的ALT氨基酸序列同源性為49%; 與草履蟲(Paramecium tetraurelia)的 ALT氨基酸序列同源性為50%; 與尾刺耐格里原蟲(Naegleria gruberi)的 ALT氨基酸序列同源性為49%。將獲得的PrALT編碼的氨基酸序列通過BLAST P搜索NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫, 發(fā)現(xiàn)該序列與三棱尖毛蟲的 ALT氨基酸序列同源性為 64%;與小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliis)的 ALT氨基酸序列同源性為50%。

保守區(qū)域分析顯示, EvALT和PrALT氨基酸序列都包括一個(gè)完整的I型轉(zhuǎn)氨酶亞基和 10個(gè)保守的輔酶磷酸吡哆醛(PLP)結(jié)合位點(diǎn)。因此, 可以判斷擴(kuò)增得到的兩條cDNA全長序列為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白家族基因。

2.3 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)

I-TASSER蛋白模型預(yù)測(cè)扇形游仆蟲丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和紅色偽角毛蟲丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu), 結(jié)果如圖1、2所示, 由無規(guī)則卷曲、α-型螺旋和β型結(jié)構(gòu)組成。

I-TASSER蛋白模型預(yù)測(cè)軟件結(jié)果表明扇形游仆蟲ALT和紅色偽角毛蟲ALT與人類ALT2 (PDB:3ihjA)結(jié)構(gòu)相似性最高, 分別達(dá) 43%和 42%。因此選取人類的ALT2為模板, 預(yù)測(cè)扇形游仆蟲 ALT和紅色偽角毛蟲ALT的空間結(jié)構(gòu), 結(jié)果如圖3、4所示。I-TASSER預(yù)測(cè)結(jié)果表明, 扇形游仆蟲ALT的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)和紅色偽角毛蟲ALT的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)與大麥(Hordeum vulgare)ALT (PDB:3tcmA)的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的整體相似性分別達(dá)97.8% 和97.7%。

2.4 ALT氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析

ALT氨基酸序列構(gòu)建最大似然樹(圖 5)。結(jié)果顯示,擴(kuò)增得到的EvALT和PrALT氨基酸序列與三棱尖毛蟲、嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)、以及草履蟲ALT氨基酸序列聚為一簇, 親緣關(guān)系最近。氨基酸序列聚類分析表明, EvALT和PrALT氨基酸序列與其他纖毛蟲種類的 ALT氨基酸序列同源性均較高, 進(jìn)一步證實(shí)該蛋白應(yīng)屬于丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族成員。

3 討論

圖1 扇形游仆蟲ALT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)圖(黑色實(shí)線表示無規(guī)卷曲; 波浪線表示α-型螺旋; 箭頭實(shí)線表示β-型結(jié)構(gòu))Fig. 1 Predicted secondary structure of E. vannus ALT (Randon coil is indicated with black solid lines; α-helix is indicated with wavy lines; β-sheet is indicated with arrow lines)

圖2 紅色偽角毛蟲ALT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)圖(黑色實(shí)線表示無規(guī)卷曲; 波浪線表示α-型螺旋; 箭頭實(shí)線表示β-型結(jié)構(gòu))Fig. 2 Predicted secondary structure of P. rubra ALT (Randon coil is indicated with black solid lines; α-helix is indicated with wavy lines; β-sheet is indicated with arrow lines)

圖3 I-TASSER蛋白模型預(yù)測(cè)的扇形游仆蟲ALT空間結(jié)構(gòu)Fig. 3 The spatial structure of E. vannus ALT predicted by I-TASSER protein model

圖4 I-TASSER蛋白模型預(yù)測(cè)的紅色偽角毛蟲ALT空間結(jié)構(gòu)Fig. 4 The spatial structure of P. rubra ALT predicted by I-TASSER protein model

扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲均為海洋水體中習(xí)見種,主要生活在水體底部, 具有部分重疊的生態(tài)位。扇形游仆蟲通常為長方形, 但在營養(yǎng)充分時(shí)蟲體常變形為闊橢圓形, 可在大范圍鹽度變化的環(huán)境內(nèi)存活并極易繁殖為水體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)種[15]; 紅色偽角毛蟲體型細(xì)長, 運(yùn)動(dòng)較慢,主要以各類小型原生生物為食[16]。因其自身的特點(diǎn), 扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲在生態(tài)毒理學(xué)中常作為檢測(cè)水體重金屬、殺蟲劑等污染的指示生物[17]。

代謝活力和代謝途徑改變是生物體生長發(fā)育過程中提高抗逆性的一條重要途徑[18], 具有重要的生理意義。轉(zhuǎn)氨酶是一類以磷酸吡哆醛為輔酶的代謝酶, 而丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶是丙氨酸代謝途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶[19], 其表達(dá)強(qiáng)度和酶活性將會(huì)影響生物個(gè)體的生長狀況。本研究所克隆得到的扇形游仆蟲丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和紅色偽角毛蟲丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶均具有轉(zhuǎn)氨酶家族Ⅰ所具有的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[20],轉(zhuǎn)氨酶家族Ⅰ的一個(gè)保守亞基折疊形成一個(gè)倒 U型的空間結(jié)構(gòu), 該結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使輔酶 PLP與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶蛋白結(jié)合較為松弛[21], 導(dǎo)致酶活性變化易于受外源異質(zhì)性物質(zhì)影響。為此, 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族Ⅰ所具有的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶作為生物標(biāo)記物提供了結(jié)構(gòu)上的可能。Wee等[22]研究發(fā)現(xiàn)鯰魚丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性能對(duì)養(yǎng)殖水體氨態(tài)鹽梯度變化做出敏感響應(yīng), 表明了該酶具有作為環(huán)境監(jiān)測(cè)生物標(biāo)記物的巨大潛力。

圖5 根據(jù)不同物種的ALT氨基酸序列構(gòu)建的最大似然樹Fig. 5 Phylogenetic tree inferred from different species of ALT amino acid sequences using maximum likelihood method

對(duì) ALT構(gòu)建最大似然樹及聚類分析, 可為不同物種間ALT親緣關(guān)系進(jìn)行比較分析。三棱尖毛蟲、嗜熱四膜蟲和草履蟲都屬于纖毛蟲原生動(dòng)物, 系統(tǒng)發(fā)育樹顯示扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲與以上三種纖毛蟲的ALT聚集為一簇, 親緣關(guān)系最近; 而與魚類和哺乳類動(dòng)物的 ALT親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 這與動(dòng)物的經(jīng)典分類一致。推測(cè)也可能是ALT在進(jìn)化過程中處于環(huán)境選擇性等壓力支配下發(fā)生了演化, 以適應(yīng)不同物種在不同的環(huán)境中更有利于發(fā)揮其生物學(xué)功能[23]。

本工作可為深入探究原生動(dòng)物ALT酶活性、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)等作為生物標(biāo)記物的研究提供重要的生物學(xué)信息。如將扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲作為指示生物,通過測(cè)定扇形游仆蟲和紅色偽角毛蟲丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)的變化, 監(jiān)測(cè)海洋養(yǎng)殖水體中漁藥、銨態(tài)氮和重金屬等污染狀況。但是有關(guān)生物標(biāo)記物的反應(yīng)模式與劑量間的關(guān)系受諸多因素的影響, 例如, 物種特異性、暴露時(shí)間、污染物性質(zhì)等, 因此, 評(píng)價(jià)酶活性、基因表達(dá)和蛋白表達(dá)等作為生物標(biāo)記物的有效性, 還需要針對(duì)以上影響因素做進(jìn)一步的研究。

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CLONING AND CHARACTERIZATION OF ALT GENE IN TWO SPECIES OF CILIATES (EUPLOTES VANNUS AND PSEUDOKERONOPSIS RUBRA)

LIU Shu-Xing, HONG Ya-Zhen, LIN Xiao-Feng and LI Ji-Qiu
(Laboratory of Protozoology, Key Laboratory of Ecology and Environment Science in Guangdong Higher Education, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

扇形游仆蟲; 紅色偽角毛蟲; 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶; RACE; 序列分析

Euplotes vannus; Pseudokeronopsis rubra; Alanine aminotransferase; RACE; Sequence characterization

Q344+.1

A

1000-3207(2015)06-1261-05

10.7541/2015.165

2014-09-23;

2015-03-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31222050, 41476128)資助

劉書興(1989—), 男, 江西上饒人; 碩士; 研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)。E-mail: liushuxing66@163.com

李繼秋, E-mail: lijiqiu@126.com