唐小梅，伍參榮，杜卓，楊維青，萬學(xué)勤，朱春霞

（1.廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523808；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410007；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，廣東佛山528000）

戊己丸水煎液對(duì)幽門螺桿菌感染SGC-7901細(xì)胞形態(tài)及凋亡的影響

唐小梅1，伍參榮2，杜卓3，楊維青1，萬學(xué)勤3，朱春霞3

（1.廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523808；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410007；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，廣東佛山528000）

摘要：目的在體外研究戊己丸水煎液對(duì)幽門螺桿菌誘導(dǎo)的SGC- 7901細(xì)胞形態(tài)及凋亡的作用。方法以SGC- 7901細(xì)胞作為幽門螺桿菌株感染的體外細(xì)胞模型，用不同濃度的戊己丸水煎液干預(yù)，倒置顯微鏡觀察SGC- 7901細(xì)胞的形態(tài)；流式細(xì)胞儀分析胃上皮細(xì)胞SGC- 7901的凋亡百分率。結(jié)果戊己丸水煎液加入幽門螺桿菌感染的細(xì)胞后，受損細(xì)胞出現(xiàn)修復(fù)；不同濃度戊己丸水煎液均可以減少幽門螺桿菌誘導(dǎo)的SGC- 7901細(xì)胞的凋亡,與陰性對(duì)照組比較差異有顯著性（p<0.05）。結(jié)論戊己丸水煎液能降低幽門螺桿菌感染的SGC- 7901細(xì)胞的凋亡率；對(duì)幽門螺桿菌感染的SGC- 7901細(xì)胞的形態(tài)有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：戊己丸水煎液；SGC- 7901細(xì)胞；幽門螺桿菌；凋亡

幽門螺桿菌（helicobacter pylori，H·pylori）與許多慢性胃部疾病，特別是與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。目前，H·pylori的感染居高不下，臨床采用抗生素抑殺H·pylori已成為基本的治療原則，但抗生素治療帶來耐藥菌株等副作用，故尋找非抗生素療法勢(shì)在必行。

中成藥戊己丸源自宋代《太平惠民和劑局方》，收錄于中國(guó)藥典2010版，是臨床治療消化性胃潰瘍、胃炎的經(jīng)典方劑。體外抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃連、吳茱萸及戊己丸的水煎液均對(duì)H·pylori有明顯的抑制作用［1］，但戊己丸防治H·pylori感染的機(jī)理尚不明確。本文通過體外試驗(yàn)探討戊己丸對(duì)H·pylori感染所致胃部疾病的作用機(jī)理。

1　材料與方法

1.1材料

H·pylori悉尼國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株SS1（sydneystrain 1），湖南中醫(yī)藥大學(xué)伍參榮教授惠贈(zèng)。

胃腺癌SGC- 7901細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室凍存。

戊己丸水煎液，按原方比例稱取藥材，由廣東醫(yī)學(xué)院中藥與新藥研究所制備，濃度為1 g/mL。

布氏培養(yǎng)基、小牛血清來自青島海博生物技術(shù)有限公司；無菌脫纖維羊血來自廣州蕊特生物有限公司；RPMI1640培養(yǎng)液來自美國(guó)Gibcobrl；胰酶來自瑞士Roche公司；其余試劑為分析純。

1.2方法

1.2.1H·pylori菌懸液的制備

在無菌條件下，將復(fù)蘇的H·pylori菌均勻涂布于布氏羊血培養(yǎng)基平板上，于37℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)，3～5 d后收集針尖樣透明菌落，用含20%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（不加雙抗）作稀釋液，將細(xì)菌的濃度調(diào)整為1×108CFU/mL。

1.2.2不同濃度戊己丸水煎液的制備

用含20%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（不加雙抗）作稀釋液，將戊己丸水煎液的濃度分別稀釋為1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察

首先在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，采用常規(guī)培養(yǎng)基即RPMI 1640培養(yǎng)液加20%小牛血清及雙抗，于37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每周換液3次，待細(xì)胞鋪滿底后，用0.25%胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。然后將稀釋好的不同濃度的戊己丸水煎液和H·pylori菌懸液加入細(xì)胞中，藥液每孔加180 μL，菌懸液每孔加20 μL，每孔液體體積200 μL，每個(gè)藥液濃度重復(fù)8孔，在37℃微需氧條件下培養(yǎng)。24 h后，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4細(xì)胞凋亡的分析（流式細(xì)胞儀）

以1×105個(gè)/mL將細(xì)胞轉(zhuǎn)種至小青霉素瓶，每瓶1 mL，于37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每周換液3次，選取長(zhǎng)滿單層且生長(zhǎng)良好的的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用Hank’S液清洗細(xì)胞2次，然后加入已經(jīng)稀釋好的不同濃度的戊己丸水煎液和H·pylori菌懸液，藥液每瓶加0.9 mL，菌懸液每瓶加0.1 mL，每瓶液體體積1 mL，每個(gè)藥液濃度重復(fù)8瓶，在37℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)。24 h后用70%乙醇固定22 h。固定好后，用PBS反復(fù)洗3次，細(xì)胞重懸于PI染液（PI終濃度為50 ug/mL）中，37℃孵育30 min進(jìn)行流式分析。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5分析，測(cè)得指標(biāo)都采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2　結(jié)果

2.1戊己丸水煎液對(duì)H·pylori感染SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響

不加細(xì)菌的SGC- 7901細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察生長(zhǎng)良好，呈多角形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞之間連接緊密，如見圖1所示。

加入H·pylori菌懸液感染后，細(xì)胞變圓，貼壁細(xì)胞減少，懸浮細(xì)胞增多，細(xì)胞周圍出現(xiàn)碎片，細(xì)胞間的連接較少甚至消失，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間分界模糊，呈現(xiàn)核質(zhì)融合狀態(tài)，觀察到細(xì)胞壞死，如圖2所示。

戊己丸水煎液加入H·pylori菌感染的細(xì)胞后，貼壁細(xì)胞和細(xì)胞間的連接明顯增多，部分受損細(xì)胞出現(xiàn)修復(fù)如圖3、4所示。

圖1　正常SGC-7901細(xì)胞40×10細(xì)胞生長(zhǎng)良好、呈多角形

圖2　H·pylori感染SGC-7901細(xì)胞40×10細(xì)胞融合、發(fā)暗、變圓、壞死

圖3　戊己水煎液濃度1︰160 40×10 無H·pylori細(xì)胞修復(fù)

圖4　戊己水煎液濃度1︰320 10×10仍有細(xì)胞壞死、部分細(xì)胞修復(fù)

2.2戊己丸水煎液對(duì)H·pylori感染SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

在細(xì)胞中加入不同濃度的戊己丸水煎液和H·pylori菌懸液，培養(yǎng)后流式細(xì)胞儀分析SGC- 7901細(xì)胞凋亡百分率結(jié)果如表1所示。

表1　戊己丸水煎液對(duì)H·pylori感染SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響

表1顯示，濃度為1∶160、1∶320、1∶640的戊己丸水煎液均可以減少H·pylori誘導(dǎo)的SGC- 7901細(xì)胞的凋亡，與陰性對(duì)照組比較差異有顯著性（p<0.05）。

3　討論

H·pylori感染與胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系是近年來的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡在調(diào)節(jié)機(jī)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及抵御外界各種因素的干擾方面起著關(guān)鍵的作用，凋亡失控與包括腫瘤在內(nèi)的許多重大疾病有著密切的聯(lián)系［2-3］。胃癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)失控是導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖促進(jìn)腫瘤發(fā)生的重要因素。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)H·pylori可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的增加，誘導(dǎo)細(xì)胞變圓、融合、壞死。加入不同濃度戊己丸水煎液后均可不同程度降低H·pylori感染SGC- 7901細(xì)胞的凋亡率，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)修復(fù)現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)表明，戊己丸水煎液可能通過抑殺H·pylori，從而保護(hù)感染細(xì)胞不壞死，使凋亡率明顯降低。

H·pylori感染誘導(dǎo)胃粘膜上皮細(xì)胞凋亡由Moss［4］等最先報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H·pylori感染細(xì)胞的凋亡率隨細(xì)菌密度增加而呈濃度依賴性升高的趨勢(shì)，該結(jié)果提示SGC- 7901細(xì)胞發(fā)生的凋亡是由H·pylori感染直接誘導(dǎo)所致，其凋亡率與H·pylori的依從性關(guān)系呈濃度依賴性，這與Wagner［5］、Chen［6］等的報(bào)道相符。姚紅［7］和吳鶯等［8］的體外實(shí)驗(yàn)也表明，H·pylori感染能引起胃上皮細(xì)胞的凋亡。楊藝等［9-10］在體外觀察到，當(dāng)H·pylori高濃度作用于上皮細(xì)胞時(shí)，H·pylori的致細(xì)胞空泡毒作用和促細(xì)胞凋亡作用占優(yōu)勢(shì)，將可能使胃粘膜出現(xiàn)損傷，H·pylori以濃度依賴方式誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞凋亡，這一論點(diǎn)支持本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與推測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，戊己丸水煎液對(duì)H·pylori感染的SGC- 7901細(xì)胞的保護(hù)，可能是通過抑殺H·pylori、抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的。是否還有其他機(jī)制，還有待進(jìn)一步深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

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【責(zé)任編輯：任小平renxp90@163.com】

The influence of Wuji Pill Solution on morphology and apoptosis of SGC- 7901 cells infected with Helicobacter pylori in vitro

TANGXiao- mei1, WUCan- rong2, DUZhuo3, YANGWei- qing1, WANGXue- qin3, ZHUChun- xia3
（1. School of Basic Medical Sciences, Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China; 2. Medical School, Hunan Universityof Chinese Medicine, Changsha 410007, China; 3. Department of Pharmacy, Foshan University, Foshan 528000, China）

Abstract:Objective To investigate the effecte of Wuji Pill Solution on morphology and apoptosis of SGC- 7901 cells infected with Helicobacter pylori (H·pylori) in vitro. Methods H·pylori were introduced to the cells. Microscope was applied toobserve the morphologyand flowcytometrywas used toanalyze the extent ofapoptosis of cells infected with H·pylori. Results The morphology of cells infected with H·pylori was repaired with Wuji Pill Solution. The apoptosis of cells were lower than that of contrast group( p＜0.05). Conclution Wuji Pill Solution decreased the apoptosis rate of SGC- 7901 cells infected with H·pylori and protected the morphology of cells infected with H·pylori .

Keywords:Wuji Pill Solution; SGC- 7901 cell; Helicobacter pylori; apoptosis

作者簡(jiǎn)介：唐小梅（1973-），女，山西大同人，廣東醫(yī)學(xué)院講師、碩士。

基金項(xiàng)目：湛江市科技攻關(guān)資助項(xiàng)目（2009C3101016）；廣東醫(yī)學(xué)院青年基金資助項(xiàng)目（XQ0713）；廣東醫(yī)學(xué)院面上基金資助項(xiàng)目（XK1445）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（S2012040007298）

收稿日期：2014-11-04

中圖分類號(hào)：R573.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008- 0171（2015）04- 0067- 04