DNA載體——聚DEAE葡聚糖和κ-卡拉膠微囊制備的可行性分析

于滿昌，劉麗，金璐娟，王東，孫英杰，黃小丹

(黑龍江職業(yè)學院150111)

摘要：DNA疫苗是一種或多種抗原編碼基因克隆到真核表達載體上，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒直接注入到體內(nèi)而激活機體免疫系統(tǒng)，被稱為DNA免疫。研制高效的 DNA 疫苗載體，提高 DNA 疫苗轉(zhuǎn)染效率，降低給藥劑量是DNA 疫苗研究中亟需攻克的難題。本文對國內(nèi)外相關(guān)研究分析得出聚DEAE-葡聚糖和κ-卡拉膠微囊作為DNA疫苗載體是可行的。

關(guān)鍵詞：DNA載體；聚DEAE葡聚糖；κ-卡拉膠；微囊

DNA疫苗的研究只是近十幾年發(fā)展起來的一項新的生物技術(shù)，已成為疫苗研究領(lǐng)域中的熱點之一，自上世紀90年代以來，DNA 疫苗因其良好的安全性及可誘導(dǎo)廣泛的體液免疫和細胞免疫，越來越受到人們的關(guān)注。美國FAD已批準乙肝疫苗等10余種DNA疫苗進入臨床試驗，這預(yù)示DNA疫苗在21世紀將成為人類和動物與各種疾病抗爭的有利武器，也顯示出DNA疫苗的巨大潛力和應(yīng)用前景?，F(xiàn)已有馬西尼羅河病毒、鮭魚傳染性出血性壞死病毒、犬黑色素瘤等三種 DNA 疫苗獲準上市，DNA疫苗在傳染病及腫瘤性疾病防治等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。DNA 疫苗進入機體后，利用宿主細胞表達系統(tǒng)合成相應(yīng)抗原蛋白，并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此，無論是制備DNA疫苗，還是進行基因治療，都要求將DNA轉(zhuǎn)染到細胞中。但多數(shù)DNA疫苗是水溶液注射劑，通過肌肉注射方式給藥。一般情況下，裸DNA僅有0.1%~0.2% 被動物細胞吸收，絕大部分被核酸酶降解，并且裸DNA被肌細胞，特別是抗原提呈細胞攝取的效率極低，免疫效果很不理想。目前，研制高效的 DNA 疫苗載體，提高 DNA 疫苗轉(zhuǎn)染效率，降低給藥劑量是DNA 疫苗研究中亟需攻克的難題。

DNA疫苗是一種或多種抗原編碼基因克隆到真核表達載體上，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒直接注入到體內(nèi)而激活機體免疫系統(tǒng)，被稱為DNA免疫。DNA疫苗由抗原編碼基因及載體兩部分組成。DNA疫苗載體分為病毒和非病毒載體兩大類。病毒載體如痘病毒、棒狀病毒、α病毒、復(fù)制缺陷型腺病毒、皰疹病毒等，其優(yōu)點是轉(zhuǎn)染效率較高，但存在攜載外源DNA容量有限、制備過程復(fù)雜等缺點，特別是在安全性方面具有潛在危險限制了其應(yīng)用。而非病毒載體主要包括脂質(zhì)體、人工合成聚合物和天然高分子等，具有安全性高、容量大和易制備等優(yōu)點，但也存在生物相容性差、轉(zhuǎn)染效率低、細胞毒性等問題。用生物可降解控釋微囊作為基因疫苗載體，理論上可長時間保持表達基因的活性，從而減少基因疫苗的劑量。

DNA以物理形式包埋在微球中，一方面聚合物與細胞作用可促進DNA轉(zhuǎn)染，另一方面，微囊能夠非特異性激活巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞，增加這些細胞對微囊的攝取量，提高轉(zhuǎn)運的靶向性和轉(zhuǎn)運效率，從而提高抗原表達水平，提高免疫效果[1]。DNA疫苗微囊的粒徑、疏水性、電荷性、降解特性等理化性質(zhì)直接影響轉(zhuǎn)運效率和免疫效果。目前DNA疫苗微囊制備，主要采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、殼聚糖、海藻酸鈉等生物降解材料。PLGA生物相容性好，在體內(nèi)最終降解為H2O和CO2。PLGA微球親水性和混懸性好，釋藥較快。但PLGA不溶于水，與水溶性的DNA疫苗大分子親和性差，因而微球制備中要用有機溶劑和高速剪切分散藥物，對藥物的穩(wěn)定性不利。海藻酸鈉為天然多糖類陰離子高分子材料，制備條件溫和，不需要有機溶劑，對DNA疫苗的穩(wěn)定性十分有利；海藻酸鈉微球的缺點是穩(wěn)定性不夠好，放置在磷酸鹽緩沖液中，可因鈉離子與鈣離子的交換致使微球破裂。殼聚糖為天然來源多糖類陽離子高分子材料，其優(yōu)點與海藻酸鈉相似；殼聚糖一般需要溶解于醋酸等弱酸溶液中，由于pH值較低，DNA疫苗容易在制備過程中降解。因而開發(fā)和采用水溶性好、轉(zhuǎn)染效率高、制備工藝穩(wěn)定、可與細胞相互作用的可降解聚合物作為微囊材料是十分必要的。

噴霧干燥法、復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法為制備DNA微球的常用方法，在制備過程中都需要超聲、高速攪拌等措施將DNA分散到有機溶液中，會造成一定程度DNA的降解。Briones等用嗅化十六烷基三甲銨等陽離子乳化劑溶液為分散介質(zhì)，采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備空白陽性微球，然后吸附DNA疫苗，制成載藥的陽性微球。這樣可以避免DNA疫苗在制備過程中的降解。表面吸附DNA疫苗的陽性微球仍具有一定的保護作用，并能延長基因表達、提高免疫效果，但是存在于微球表面DNA會在體內(nèi)降解。因此，簡化制備DNA微囊工藝，且增加微囊內(nèi)的DNA容量，也是DNA疫苗微囊制備的關(guān)鍵技術(shù)。CaCO3對DNA具有很好的吸附性，廣泛用于DNA的回收；而CaCO3微粒具有多孔、表面積大的特點，進一步提高對DNA的吸附性能，形成的均一的CaCO3-DNA微粒利于包被成微囊。

在基因傳遞的各類聚合物中，多聚糖是被公認的最具潛力的DNA載體，具有天然、無毒、良好的生物降解性及生物相容性等特點。其中DEAE-葡聚糖促使哺乳動物細胞捕獲外源DNA已經(jīng)被證實，其機理還不明確，有人認為DEAE-葡聚糖同DNA結(jié)合成復(fù)合物，可以保護DNA免受核酸酶的降解作用；還有人認為DEAE-葡聚糖可以同細胞膜發(fā)生作用，從而使DNA容易穿過細胞表面而進入細胞內(nèi)。因而以DEAE-葡聚糖包被DNA，提高轉(zhuǎn)染效率是可行的。但是DEAE-葡聚糖如何在CaCO3-DNA微粒表面形成穩(wěn)定囊膜，目前還未見報道。

有研究表明，在卡拉膠與葡聚糖具有表現(xiàn)出極好的相容性。在卡拉膠-葡聚糖混合體系中，葡聚糖的存在不妨礙卡拉膠有序結(jié)構(gòu)的形成，反而增強了體系網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[2]。葡聚糖由于其極細的粒度，高度的持水性與分散性，均勻填充至卡拉膠所成的有序網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，以弱作用力與構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)的卡拉膠分子鏈結(jié)合，維系了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)?？ɡz是一種硫酸半乳聚糖，體外實驗證明其對正常細胞無不良影響，具有廣譜抗被膜病毒(單純皰疹病毒、流感病毒、非洲豬瘟病毒、艾滋病病毒等)活性。有專家將硫酸化多糖-卡拉膠與人乳頭瘤病毒16(HPV-16)E7肽疫苗聯(lián)合，能產(chǎn)生抗原特異性反應(yīng)和抗腫瘤效果，借助TLR4活化途徑，可見卡拉膠還具有一定的免疫刺激功能。

終上所述，DEAE-葡聚糖和κ-卡拉膠作為DNA疫苗載體是可行的。

參考文獻：

[1] 宋健，陳磊，李效軍，等.微膠囊化技術(shù)及應(yīng)用[M].北京:化學工業(yè)出版社，2004.

[2] Van de velde F.，De Ruiter G A.，Polysaccharide II Polysaccharides from Eukaryotes[M]. Weinheim:Wiley-VCH. 2002.