吳巍蕓　周　宇

作者單位：524001 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

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miR-20b對大腸癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制的研究

吳巍蕓周宇

作者單位：524001 廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

【摘要】目的探討miR-20b對大腸癌(CRC)細胞增殖凋亡的影響及機制。方法將miR-20b模擬物轉(zhuǎn)染CRC細胞株HCT-116，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-20b的表達，分別應(yīng)用CCK-8實驗及流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖和凋亡情況。qRT-PCR和western blot檢測轉(zhuǎn)染后Bcl-w mRNA和蛋白的表達情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-20b 模擬物后，HCT-116細胞中miR-20b表達水平明顯上調(diào)，HCT-116細胞增殖減弱(P<0.05)，凋亡增強(P<0.05)。miR-20b可作用于Bcl-w mRNA 的3′-UTR，使海腎熒光素酶活性顯著降低。轉(zhuǎn)染后Bcl-w mRNA及蛋白表達水平明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論上調(diào)HCT-116細胞中miR-20b表達水平，可抑制其靶基因Bcl-w的表達，發(fā)揮抑制細胞增殖、增加凋亡的作用。

【關(guān)鍵詞】微小RNA；大腸癌；Bcl-w；增殖；凋亡

(ThePracticalJournalofCancer，2015，30:0020～0024)

大腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)生、發(fā)展是多因素參與的過程。原癌基因和抑癌基因的異常表達及其編碼蛋白功能的改變可影響腫瘤發(fā)生的多個方面，包括細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥以及維持遺傳基因穩(wěn)定等[1]。微小RNA (microRNA，miRNA，miR)是一類非編碼單鏈小分子RNA，其與靶基因mRNA的3'非編碼末端(3'-UTR)完全和部分互補性結(jié)合，從而引起靶mRNA的降解或者阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯，與腫瘤[2]、心血管疾病[3]、炎癥[4]等病理生理過程相關(guān)。多個研究發(fā)現(xiàn)，與正常大腸組織相比，CRC存在多種miRNA表達異常[5-7]。其中基因芯片檢測顯示miR-20b在CRC組織中表達明顯下調(diào)[5]，本實驗通過分析miR-20b對CRC細胞的增殖、凋亡的影響及對其潛在靶基因Bcl-w的調(diào)控，探討miR-20b在CRC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1材料與方法

1.1主要材料及試劑

人大腸癌細胞株HCT-116購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000(lipo2000)購自美國Invitrogen公司，Opti-MEM I培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。人miR-20b 模擬物(mimics)、miRNA-20b mimics陰性對照(miR-20b mimics-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購自上海Dojindo公司。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、小鼠抗人β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗人Bcl-w抗體購自美國Santa Cruz公司。 RNAiso Plus、One Step PrimeScript(R)miRNA cDNA Synthesis Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR(R)Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)均購自大連Takara公司。TIANGEN高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技有限公司。雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測試劑盒購自Promega公司。miR-20b、U6、Bcl-w、β-actin引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HCT-116細胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將HCT-116細胞接種至6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h待細胞長至60%左右融合時轉(zhuǎn)染。實驗分為2組：①miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組：使用lipo2000將miR-20b mimics(終濃度100 nmol/L)轉(zhuǎn)染入細胞；②NC組：使用lipo2000將miR-20b mimics-NC(終濃度100 nmol/L)轉(zhuǎn)染入細胞。

1.3實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染后miR-20b的表達

各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用RNAiso Plus提取總RNA。PrimeScript(R)miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。所得cDNA再使用試劑盒進行PCR反應(yīng)。miR-20b以U6作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸20 s，擴增40個循環(huán)。qRT-PCR引物序列如下：miR-20b 上游引物，5′-CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG-3′；U6上游引物，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；miRNA下游引物Uni-miR、qPCR、Primer包含在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中。每個反應(yīng)設(shè)3個復(fù)孔，miR-20b的相對表達量用2-△Ct法計算。

1.4CCK-8法檢測miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后細胞增殖情況

將HCT-116細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，按上述分組轉(zhuǎn)染，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔更換新鮮培養(yǎng)基200 μl，再加20 μL CCK-8溶液。培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度。記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。

1.5流式細胞儀檢測miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后細胞凋亡情況

HCT-116細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)板，按上述分組轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，胰酶消化、收集細胞，PBS洗滌1次，離心后加入Annexin V-FITC室溫避光孵育10 min。離心后棄上清，加入碘化丙啶(PI)染色液，冰浴避光放置30 min。進行流式細胞儀檢測。

1.6雙熒光素酶報告基因檢測

通過TargetScan Human 6.2(http：//www.targetscan.org/)、microRNA.org(http：//www.microrna.org)等常用的生物信息學(xué)網(wǎng)站，預(yù)測miR-20b的潛在靶基因及其結(jié)合位點。PCR擴增包含miR-20b結(jié)合位點在內(nèi)的Bcl-w 3′-UTR序列。將目的序列與雙熒光素酶報告基因載體連接后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞中，擴增，應(yīng)用TIANGEN高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒。將含預(yù)測結(jié)合位點的Bcl-w 3′-UTR序列的質(zhì)粒命名為pmiR-Bcl-w-wt，含Bcl-w 3′-UTR突變序列的質(zhì)粒命名為pmiR-Bcl-w-mut。將pmiR-Bcl-w-wt或pmiR-Bcl-w-mut分別與miR-20b mimics或miR-20b mimics-NC共轉(zhuǎn)染HCT-116細胞。培養(yǎng)48 h后，檢測各組海腎及螢火蟲熒光素酶活性，兩者比值進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7qRT-PCR檢測miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后Bcl-w mRNA的表達

各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，用RNAiso Plus提取總RNA。使用PrimeScript(R)RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒進行mRNA逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)所得的cDNA再使用SYBR(R)Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒進行PCR反應(yīng)。以β-actin作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸20 s，擴增40個循環(huán)。引物序列如下：Bcl-w上游引物，5′-TTCACCCTACCCTCTACCA-3′；Bcl-w下游引物，5'-AGCCCTTTACCCTTTCAG-3'；β-actin上游引物，5′-GGCGGCA-ACACCATGTACCCT-3′；β-actin下游引物，5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.8Western blot檢測miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后Bcl-w蛋白的表達

用細胞裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量后，SDS-PAGE電泳分離總蛋白，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，抗Bcl-w抗體(1∶800)及抗β-actin抗體(1∶1000)4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠二抗(1∶1000)室溫孵育1 h，用ECL發(fā)光液顯影，X光壓片曝光。應(yīng)用Quantity One軟件對條帶進行分析。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩個獨立樣本t檢驗。

2結(jié)果

2.1miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后細胞miR-20b表達上調(diào)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與miR-20b mimics-NC轉(zhuǎn)染組比較，miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組miR-20b表達水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1　CRC細胞轉(zhuǎn)染后各組miR-20b的表達情況

2.2過表達miR-20b抑制HCT-116細胞增殖

轉(zhuǎn)染miR-20b mimics至HCT-116細胞，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后，CCK-8檢測細胞增殖情況。由圖2可見，培養(yǎng)48 h、72 h、96 h時，miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組在450 nm處的吸光度較相應(yīng)的NC組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2　CCK-8法檢測兩組細胞增殖情況

2.3過表達miR-20b促進HCT-116細胞凋亡

轉(zhuǎn)染miR-20b mimics至HCT-116細胞，培養(yǎng)72 h后應(yīng)用流式細胞儀檢測。miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組Annexin V-FITC單陽性細胞較NC組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

2.4雙熒光素酶報告基因檢測

在轉(zhuǎn)染pmiR-Bcl-w-wt質(zhì)粒的實驗中，miR-20b mimics組與NC組相比較，海腎/螢火蟲熒光素酶活性下降，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在轉(zhuǎn)染pmiR-Bcl-w-mut質(zhì)粒的實驗中，miR-20b mimics組與NC組相比較，海腎/螢火蟲熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)(圖4)。

2.5miR-20b mimics轉(zhuǎn)染后HCT-116細胞中Bcl-w表達水平下調(diào)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-20b mimics-NC組比較，miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組細胞Bcl-w mRNA的表達水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5A)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-20b mimics-NC組比較，miR-20b mimics轉(zhuǎn)染組細胞Bcl-w蛋白的表達水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5B和5C)。

3討論

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有重要調(diào)控作用的非編碼小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)，多種人類腫瘤，包括CRC，都伴有miRNA的表達異常。miRNA通過靶基因的調(diào)控，對腫瘤細胞生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程起作用。Yu等[8]發(fā)現(xiàn)，miR-208在人CRC組織中較正常組織表達下降，并與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度相關(guān)，表達低的患者比表達高的患者生存時間更短，說明在大腸癌中miRNA的異常表達與腫瘤的特性和患者的預(yù)后相關(guān)。miR-154在CRC組織和細胞系中表達降低，過表達miR-154通過作用于其靶基因toll樣受體2(TLR2)，抑制CRC細胞增殖、克隆形成、侵襲、轉(zhuǎn)移等，發(fā)揮抑癌作用[9]。miR-20b與腫瘤的關(guān)系也有少量研究。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-20b在缺氧的微環(huán)境下可以降低乳腺癌細胞的血管內(nèi)皮生長因子表達[10]?；蛐酒Y(jié)果也顯示，miR-20b在CRC組織較正常大腸組織表達下調(diào)[5]，但miR-20b如何影響大腸癌的發(fā)生、發(fā)展呢？本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-20b mimics至HCT-116細胞后，大腸癌細胞HCT-116的miR-20b表達上調(diào)，同時細胞增殖明顯受抑，而細胞凋亡率增高，提示miR-20b與CRC細胞的增殖密切相關(guān)。

圖3　兩組細胞凋亡圖

以NC組為1，mimics組表示為NC組的倍數(shù)。

Bcl-w是 Bcl-2家族抗凋亡成員之一，過表達Bcl-w使細胞凋亡減少。Bcl-w與CRC形成和進展密切相關(guān)[11]。在CRC組織中，Bcl-w表達率顯著升高，且與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Bcl-w與CRC的進展有關(guān)[12]。張雋等[13]也發(fā)現(xiàn)，Bcl-w在大腸腺瘤組織中不表達，而在CRC表達明顯增高，且隨腫瘤浸潤深度增加和淋巴轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，Bcl-w表達亦增加，同時Bcl-w表達陽性CRC患者預(yù)后差，也支持上述Bcl-w與CRC的進展有關(guān)的觀點。我們通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)Bcl-w是miR-20b潛在的靶基因之一，并進一步通過雙熒光素酶報告基因證實miR-20b能與Bcl-w的3′-UTR結(jié)合。轉(zhuǎn)染miR-20b mimics后，Bcl-w mRNA和蛋白的表達水平均下調(diào)，與對照組比較，差異有顯著性，說明在CRC細胞中，miR-20b通過與Bcl-w的3'-UTR結(jié)合，調(diào)控Bcl-w的表達，進而影響細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，miR-20b在CRC的發(fā)生發(fā)展中起一定作用，為CRC預(yù)防及治療提供新的靶標(biāo)。但是miRNA的調(diào)控機制復(fù)雜，一個miRNA不止一個靶基因，因此miR-20b在CRC的功能仍有廣闊的研究前景。

A為兩組Bcl-w mRNA表達情況，B為兩組Bcl-w蛋白表達情況，C為Western blot檢測兩組Bcl-w蛋白表達情況。

圖5miR-20b對HCT-116細胞Bcl-w表達的影響

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(編輯：吳小紅)

Effect of MiR-20b on Proliferation and Apoptosis of Colorectal Cancer Cells and Its Mechanism

WUWeiyun，ZHOUYu.DepartmentofGastroenterology，AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege，Zhanjiang，524001

【Abstract】Objective To explore the effect and mechanism of on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells.MethodsAfter transfection of miR-20b mimics into HCT-116 cells，the expression of miR-20b was evaluated by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR)，and effect of miR-20b on cell proliferation and apoptosis was determined by CCK-8 assay and flow cytometry，respectively.Bcl-w mRNA and protein was measured by qRT-PCR and western blot.ResultsMiR-20b mimics transfection significantly increased miR-20b expression in HCT-116 cells，inhibited cells proliferation and increased cells apoptosis (P<0.05).MiR-20b could effect on 3′-untranslated region (3′-UTR) of Bcl-w mRNA and decrease renilla luciferase activity.MiR-20b mimics significantly suppressed Bcl-w mRNA and protein level in CRC cells (P<0.05).ConclusionOverexpression of miR-20b in HCT-116 cells may suppress cells proliferation and increase cells apoptosis，probably by downregulating its target gene Bcl-w expression.

【Key words】MicroRNA；Colorectal cancer；Bcl-w；Proliferation；Apoptosis

(收稿日期2014-04-29修回日期 2014-09-30)

中圖分類號：R735.3+4

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)01-0020-05

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.006

通訊作者：周宇