譚文華　劉　巍　李委佳　麻世紅　王瑞雪

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FTY720對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究

譚文華劉巍李委佳麻世紅王瑞雪

【摘要】目的探討FTY720對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3增殖的影響及其誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。方法應(yīng)用不同濃度的FTY720作用于卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及分析細(xì)胞周期的變化，Western-blot法分析凋亡相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果FTY720對(duì)OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞系增殖的抑制作用具有時(shí)間、劑量依賴性。隨著FTY720作用時(shí)間的延長(zhǎng)，OVCAR-3細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，且G1期細(xì)胞比例逐漸上升。Western-blot結(jié)果顯示Caspase3和Caspase9都受到了激活。結(jié)論FTY720可以誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3發(fā)生凋亡，并且激活內(nèi)源性Caspase途徑和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，這可能是FTY720抑制卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】FTY720；OVCAR-3；細(xì)胞周期；作用機(jī)制

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0013～0016)

卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占婦科腫瘤的第三位，病死率占婦科惡性腫瘤之首，目前其確切的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。卵巢癌的早期診斷很困難，約70%的患者就診時(shí)已是晚期，約75%在Ⅰ期治療后就會(huì)復(fù)發(fā)、預(yù)后差[1]。手術(shù)輔以化療是卵巢癌的主要治療原則，然而目前針對(duì)卵巢癌的化療藥物的療效不甚理想，這促使我們要不斷的尋求抗卵巢癌新的治療靶點(diǎn)以及方法來(lái)提高患者的治療效果[2-4]。FTY720(2-amino-(2-[4-octylphenyl]ethy)-1，3-propanedial hydrochloride)是1種新合成的免疫抑制劑。目前其臨床試驗(yàn)主要用于預(yù)防腎移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)[5]及治療復(fù)發(fā)的多發(fā)性硬化癥[6]。FTY720除了具有免疫抑制作用外，最近對(duì)于其治療惡性腫瘤的研究已經(jīng)成為國(guó)際上的熱點(diǎn)[7]。多項(xiàng)研究表明，F(xiàn)TY720可以促進(jìn)人類腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而起到抗腫瘤的作用，包括多發(fā)性骨髓瘤[8]、肝癌[9]、前列腺癌[10]、乳腺癌[11]、腎腫瘤[12]和膀胱癌[13]。然而，關(guān)于FTY720對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響的研究還很少，因此，本課題旨在觀察FTY720在細(xì)胞水平對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，最終確定FTY720對(duì)卵巢癌的治療效果及其機(jī)制，為FTY720應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1人卵巢癌細(xì)胞系

人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3購(gòu)于ATCC(American Type Culture Collection)公司。細(xì)胞培養(yǎng)于含HEPS 25 mmol/L、谷氨酰胺2.0 mmol/L、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL和10%滅活小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基(GIBCO BRL公司)中。

1.2主要試劑及儀器

FTY720購(gòu)于圣克魯斯生物技術(shù)公司，MTT試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購(gòu)于北京嘉美紐諾生物技術(shù)公司，Caspase-3、Caspase-9多克隆抗體、流式細(xì)胞儀(FAC Scan，Becton Dickinson，美國(guó))，蛋白質(zhì)印記(Western blotting)檢測(cè)試劑盒(SA2022)。蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3主要方法

1.3.1MTT法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞生存率FTY720終濃度分別為0 μM、5 μM、10 μM、15 μM、20 μM，培養(yǎng)48 h后檢測(cè)FTY720不同濃度下對(duì)卵巢癌細(xì)胞生存率的影響；再將不同濃度的FTY720分別培養(yǎng)0、12、24、48、72 h，觀察隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)FTY720對(duì)卵巢癌細(xì)胞生存率的影響。

1.3.2Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞凋亡率選取不同濃度的FTY720(選用特定濃度的FTY720)加入試劑盒作用24～48 h，懸浮上述細(xì)胞離心、收集，貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞，加入Annexin V-FITC混勻后反應(yīng)5～15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩株卵巢癌細(xì)胞的凋亡率。檢測(cè)數(shù)據(jù)輸入Macintosh650計(jì)算機(jī)應(yīng)用Cell Quest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每次計(jì)算10 000個(gè)細(xì)胞。

1.3.3FTY720作用于卵巢癌細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)應(yīng)用Real-time PCR、Western blotting方法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達(dá)。提取卵巢癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)；測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度；蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；將蛋白樣本轉(zhuǎn)膜；按照試劑盒所示采用蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)。其中，一抗效價(jià)是1∶500～1∶1 000，選擇對(duì)照為actin(50 μg)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，對(duì)計(jì)量資料采用方差齊性檢驗(yàn)，如果方差齊性，則應(yīng)用單因素方差分析法檢驗(yàn)總體均數(shù)差異性，有顯著差異的再進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1FTY720對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3的生長(zhǎng)抑制作用(圖1)

FTY720對(duì)OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制作用具有明顯時(shí)間和計(jì)量依賴性。選定5個(gè)不同濃度(0 μM、5 μM、10 μM、15 μM、20 μM)FTY720作用于OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞系，作用24 h時(shí)，F(xiàn)TY720對(duì)卵巢癌細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，IC50(被抑制一半時(shí)抑制劑的濃度)值約為10 μM；作用48 h時(shí)抑制效果變得更加明顯。因此，選用10 μM、15 μM這兩個(gè)濃度進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

2.2FTY720誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3的凋亡

10 μM、15 μM的FTY720作用于OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞系48 h后，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測(cè)凋亡情況。發(fā)現(xiàn)10 μM FTY720可以明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，15 μM FTY720的效果則更加明顯，早期和晚期的凋亡均能觀察到，見(jiàn)圖2。

2.3FTY720體外誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3發(fā)生G1期阻滯

10 μM、15 μM的FTY720作用于OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞系48 h后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的情況，發(fā)現(xiàn)FTY720可以有效使OVCAR-3細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯在G1期，見(jiàn)圖3。

2.4FTY720通過(guò)Caspase途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3發(fā)生凋亡

Western-blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TY720(10、15 μM)作用于OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞系后，可以明顯引起前體Caspase 3、Caspase 9的減少，表明caspase通路在FTY720作用后受到了激活，見(jiàn)圖4。

圖1　MTT法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況

圖2　流式細(xì)胞儀檢測(cè)OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞系凋亡情況

圖3　流式細(xì)胞儀檢測(cè)OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞系凋亡情況及G1期細(xì)胞百分率

圖4　Western blotting法檢測(cè)結(jié)果

3討論

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中死亡率極高的1種，因此對(duì)于卵巢癌的治療已經(jīng)成為了人們關(guān)注的熱點(diǎn)，而化療是治療卵巢癌的一項(xiàng)重要手段，它可以有效地提高患者的生存期。然而，化療藥物的副作用及耐藥性嚴(yán)重影響了化療的效果，很多患者往往死于化療藥物的副作用而非卵巢癌本身，因此，尋找1種低毒性的化療藥物至關(guān)重要。FTY720是由中藥冬蟲夏草改造的1種新型免疫抑制劑，近期對(duì)于FTY720在治療惡性腫瘤的研究已經(jīng)成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞水平來(lái)探討FTY720對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3增殖的影響及其作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)TY720在體外作用24 h后可以有效抑制卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3的生長(zhǎng)，并且它的IC50值約為10 μM，并且與傳統(tǒng)的化療藥物順鉑相比有著更小的毒副作用。同時(shí)，流式細(xì)胞儀的結(jié)顯示，F(xiàn)TY720的濃度為10 μM時(shí)，可以明顯誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3發(fā)生早期和晚期的凋亡，不僅如此，還可以使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯在G1期。這些結(jié)果證明了FTY720能夠明顯抑制卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3的增殖，因此它對(duì)于卵巢癌細(xì)胞有著明顯的治療效果，因此可以進(jìn)一步研究并應(yīng)用到卵巢癌的臨床治療中。此外，我們還進(jìn)一步研究了FTY720引起卵巢癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，結(jié)果顯示FTY720作用于卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3后Caspase3、9被激活。眾所周知，Caspase的活化是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，而死亡受體的結(jié)合相應(yīng)配體(典型代表為Fas2FasL)以及應(yīng)激條件下線粒體釋放細(xì)胞色素C和Smac/DIABLO等內(nèi)容物是Caspase激活的兩條重要途徑，其中，Smac/DIABLO是1種新近發(fā)現(xiàn)的線粒體膜間蛋白，與細(xì)胞色素C一樣是Caspase的線粒體激活因子。該結(jié)果提示內(nèi)源性凋亡系統(tǒng)在FTY720作用后被活化，線粒體跨膜電勢(shì)降低，釋放細(xì)胞色素C，最終啟動(dòng)Caspase酶系，導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生。綜上所述，藥物FTY720在人卵巢癌OVCAR-3中具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并且可能是通過(guò)激活內(nèi)源性Caspase途徑和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果為今后將FTY720應(yīng)用于臨床治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，F(xiàn)TY720可以明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，并且使細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯于G1期，并且通過(guò)激活內(nèi)源性Caspase途徑來(lái)誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3發(fā)生凋亡。因此我們推斷FTY720可能是通過(guò)激活內(nèi)源性Caspase途徑和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)卵巢癌細(xì)胞OVCAR-3的凋亡作用。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為我們以后對(duì)于FTY720應(yīng)用于臨床的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論數(shù)據(jù)。為今后研究FTY720作用于卵巢癌的具體機(jī)制有著一定的提示作用。

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(編輯：吳小紅)

Effect and Mechanism of FTY720 on the Proliferation of Ovarian Cancer Cells

TANWenhua，LIUWei，WANGRuixue.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，theSecondHospitalAffiliatedtoHarbinMedicalUniversity，Harbin，150086

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of FTY720 on the proliferation of OVCAR-3 ovarian cancer cells and its mechanism of apoptosis-inducing in vitro.MethodsOVCAR-3 cells under different concentration of FTY720 were collected.The inhibition rates of cells were determined by MTT assay to evaluate the effect of FTY720.The percentage of apoptosis and cell cycle progression were detected by Annexin V-FITC/PI.Apoptosis related proteins were determined by western-blot.ResultsGrowth inhibition and apoptosis induction were evoked by different concentrations of FTY720 in OVCAR-3 cells in time and concentration dependent manner.FTY720 greatly inhibited human ovarian cancer cell OVCAR-3 proliferation.This effect was associated with G1phase cell cycle arrest and apoptosis.Wester-blot showed that caspase3 and caspase9 were activated.ConclusionFTY720 can inhibit the proliferation and induce OVCAR-3 cells apoptosis.Apoptosis induced by FTY720 may be regulated through G1phase cell cycle arrest and the activation of endogenous caspase pathway.

【Key words】FTY720；OVCAR-3 cells；Cell cycle；Mechanism

(收稿日期2014-04-29修回日期 2014-09-30)

中圖分類號(hào)：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2015)01-0013-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.004

通訊作者：王瑞雪

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳課題(編號(hào)：12511196)
作者單位：150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科