張文昌，陳敬賢，2，王明麗

人巨細(xì)胞病毒pUL76蛋白非保守C端與蛋白聚集體形成的研究

張文昌1，陳敬賢1，2，王明麗1

摘要目的 通過分別構(gòu)建人巨細(xì)胞病毒（HCMV）UL76基因編碼蛋白的全長(zhǎng)以及保守N端和非保守C端的真核表達(dá)質(zhì)粒，探討pUL76引起核內(nèi)蛋白聚集體形成的決定序列。

方法 根據(jù)GenBank中HCMV AD169（FJ527563．1）株基因序列設(shè)計(jì)分別用于擴(kuò)增pUL76全長(zhǎng)以及保守N端和非保守C端的引物，將3段序列分別構(gòu)建至增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)載體（pEGFP-N1）中，經(jīng)雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確構(gòu)建?？蛰d體和3種重組質(zhì)粒分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）和人肝癌細(xì)胞（HepG-2），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄（RTPCR）和Western blot法驗(yàn)證各段基因的正確表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒后細(xì)胞核內(nèi)蛋白聚集體形成的狀態(tài)。結(jié)果 pEGFP-N1空載體和pUL76保守N端均不能引起核內(nèi)蛋白聚集體的形成，而pUL76及其非保守C端均能夠引起核內(nèi)蛋白聚集體的形成。結(jié)論 pUL76非保守C端是其引起核內(nèi)蛋白聚集體形成所必須的。

關(guān)鍵詞人巨細(xì)胞病毒；UL76；蛋白聚集體

2015－01－19接收

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，合肥 230032

2哥倫比亞大學(xué)病理與細(xì)胞生物學(xué)系，紐約 10032

皰疹病毒有著相似的結(jié)構(gòu)和復(fù)制周期，有一些基因行使著相同或相近的功能，比如用于DNA合成的DNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等。現(xiàn)已知皰疹病毒家族的3個(gè)亞科中約有40個(gè)核心基因來自共同祖先［1］，且這些基因在3個(gè)亞科中都保守。通常將從共同祖先繼承而來，在不同亞科中的同源基因構(gòu)成1個(gè)基因家族。皰疹病毒UL24基因家族即屬于這40個(gè)核心基因之一，其編碼的氨基酸序列N端高度保守，C端變異較大［2］。該基因家族在病毒整個(gè)復(fù)制周期以及潛伏感染中的作用研究較少。人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬于皰疹病毒β亞科，其UL76基因?qū)儆诎捳畈《綰L24基因家族。研究［3］表明UL76轉(zhuǎn)染細(xì)胞最顯著的特征是引起細(xì)胞核內(nèi)蛋白聚集體的形成。該研究通過分別構(gòu)建pUL76及其保守N端和非保守C端的真核表達(dá)質(zhì)粒，確定了pUL76引起蛋白聚集體的決定序列。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 HCMV AD169毒株由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供；人胚肺成纖維細(xì)胞（human embryonic lung fibroblast，HELF）和人肝癌細(xì)胞（human hepatoma，HepG-2）購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；HELF細(xì)胞、HepG-2細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（內(nèi)含100 U／ml青霉素，100 g／ml鏈霉素）在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。pEGFP-N1質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司；脂質(zhì)體2000購(gòu)自北京Invitrogen公司；T4 DNA連接酶、BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司；Rabbit-anti-GFP抗體、蛋白質(zhì)提取試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；引物由北京Invitrogen公司合成。

1．2 方法

1．2．1 質(zhì)粒構(gòu)建 PCR分別擴(kuò)增出HCMV UL76全長(zhǎng)、UL76保守N端和UL76非保守C端的編碼序列。用于擴(kuò)增各片段的PCR引物如下：UL76全長(zhǎng)（325aa）F：5′-AAGCTTATGCCGTCCGGGCGT-3′，R：5′-GGATCCGCTAAAGACCGTGTGGGACGGCG-3′；

UL76N（1～190aa）F：5′-AAGCTTATGCCGTCCGGGCGT-3′，R：5′-GGATCCGCCCGTCCCAGATAGTC-3′；UL76C（187～325aa）F：5′-AAGCTTATGGACTATCTGGGACGGCG-3′，R：5′-GGATCCGCTAAAGACCGTGTGGGACGGCG-3′。各片段分別連接至pEGFP-N1真核表達(dá)載體，所形成的新的重組質(zhì)粒分別命名為pEGFP-UL76、pEGFP-UL76N和pEGFP-UL76C。陽性克隆經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定后，保菌并提取適量質(zhì)粒DNA用于轉(zhuǎn)染。

1．2．2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光顯微鏡觀察 轉(zhuǎn)染前1 d HELF細(xì)胞1×106／ml（或HepG-2細(xì)胞2×105／ml）密度鋪于6孔板中。分別將2．5 μg質(zhì)粒和5 μl脂質(zhì)體2000混勻于500 μl無血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，室溫靜置5 min后將兩者輕輕混勻，室溫

放置20 min。在此過程中用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。最后吸盡PBS，將1 ml混合液加到細(xì)胞中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后換含有血清和抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基，并于熒光顯微鏡下觀察。

1．2．3 逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR） 轉(zhuǎn)染后48 h，用PBS洗滌細(xì)胞3次。6孔板每孔加入500 μl TRIzol試劑。RNA提取采用生工總RNA提取試劑盒（SK1322）。用于cDNA合成的RNA先用DNaseⅠ處理，然后由RevertAid First Strand cDNA Synthesis kits合成，每20 μl體系加1 μg模版RNA。RT-PCR所用引物同克隆引物。

1．2．4 Western blot法檢測(cè) 轉(zhuǎn)染后48 h，用PBS洗滌細(xì)胞3次。6孔板每孔加入150 μl蛋白裂解液（含PMSF 1 μmol／L），冰上裂解30 min，期間每隔10 min晃動(dòng)平板使裂解液均勻覆蓋。收集裂解液于－80℃保存。然后采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE分離目的蛋白，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜80 min。轉(zhuǎn)印了蛋白的PVDF膜用3%的脫脂奶粉封閉1 h。Rabbit-anti-GFP一抗1∶600倍稀釋，孵育過夜。PBST洗滌3次后用HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（1 ∶5 000）孵育1 h，PBST洗滌3次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法曝光。

2 結(jié)果

2．1 PCR擴(kuò)增UL76全長(zhǎng)以及UL76保守N端和UL76非保守C端的編碼序列 采用梯度退火溫度摸索PCR擴(kuò)增UL76、UL76保守N端（1～190aa）和非保守C端（187～325aa）3個(gè)不同片段的最適退火溫度。PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。見圖1。

2．2 UL76、UL76N（1～190aa）、UL76C（187～325aa）連接至pEGFP-N1 雙酶切UL76、UL76N（1 ～190aa）、UL76C（187～325aa）連接至pEGFP-N1后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切。見圖2。酶切結(jié)果顯示3種不同的片段都成功連接至真核表達(dá)載體pEGFP-N1上。

2．3 3種重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與HCMV AD169株UL76基因比對(duì) 采用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的HCMV AD169株（FJ527563．1）UL76基因序列進(jìn)行比對(duì)，散點(diǎn)圖中對(duì)角線兩側(cè)相同位置出現(xiàn)相應(yīng)的散點(diǎn)，表明序列有一致性?？v坐標(biāo)代表目的序列，從下至上方向?yàn)樽x碼框方向；橫坐標(biāo)代表3個(gè)重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果，從左至右為讀碼框方向，A、B、C分別與目的序列全長(zhǎng)、N端和C端序列相同。見圖3。

2．4 pUL76、pUL76保守N端和pUL76非保守C端亞細(xì)胞定位的不同以及引起蛋白聚集體形成的差異 將4種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG-2細(xì)胞和HELF細(xì)胞。見圖4、5。轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）可以很好的顯示目的片段在細(xì)胞內(nèi)的定位，另外蛋白聚集體可以通過熒光信號(hào)聚集在細(xì)胞內(nèi)形成斑塊樣結(jié)構(gòu)

來體現(xiàn)，圖4 B、D中紅色箭頭箭頭所指為細(xì)胞核內(nèi)蛋白聚集體的形成。

2．5 RT-PCR和Western blot法驗(yàn)證各重組質(zhì)粒的正確表達(dá) 因?yàn)槟壳皼]有商品化的UL76抗體，但是各重組質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白均含有EGFP-tag，所以本研究采用抗EGFP抗體來檢測(cè)各融合蛋白的表達(dá)。經(jīng)蛋白質(zhì)分子量預(yù)測(cè)，EGFP-tag按27 ku計(jì)算，各融合蛋白大小應(yīng)為：pEGFP-N1為27 ku，pEGFP-UL76為63 ku，pEGFP-UL76N為49 ku，pEGFPUL76C為41 ku。見圖7。

3 討論

研究［2］表明皰疹病毒UL24家族成員都能夠引起細(xì)胞周期阻滯，生物信息學(xué)分析顯示該家族成員有潛在的核酸內(nèi)切酶活性［4］。其他一些功能也在部分UL24家族成員中得到驗(yàn)證，如HSV-1 UL24（皰疹病毒α亞科）與病毒毒力相關(guān)［5］，能引起核仁素的重新分布等［6-7］。皰疹病毒β亞科的HCMV UL76不僅能夠調(diào)節(jié)病毒自身基因（立即早期、早期以及晚期基因）的表達(dá)［8］，還能夠調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)，如誘導(dǎo)IL-8的表達(dá)［9］；致染色體損傷［10］；引起核內(nèi)蛋白聚集體的形成［3］等。皰疹病毒γ亞科如KSHV的ORF20目前研究較少。

細(xì)胞內(nèi)一些異常的或不正確折疊的蛋白會(huì)給細(xì)

胞本身代謝帶來不利的影響，這些蛋白需要被及時(shí)識(shí)別和清理。在細(xì)胞質(zhì)中，錯(cuò)誤折疊的蛋白能夠通過兩種途徑被降解：泛素化降解途徑和溶酶體參與的自噬途徑。而在細(xì)胞核中錯(cuò)誤折疊的蛋白只能夠通過泛素化降解途徑來清理［11］，當(dāng)錯(cuò)誤折疊蛋白產(chǎn)生過多以致超出它們的降解能力或蛋白酶體功能自身受損（如泛素化蛋白受體S5a被扣留）后，錯(cuò)誤折疊蛋白會(huì)進(jìn)一步形成蛋白聚集體。一些嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病如克雅病就是與細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白不能夠被清除，進(jìn)而形成聚集體有關(guān)［12］。

研究［3］顯示，UL76可以通過與泛素化降解途徑受體S5a相互作用引起核內(nèi)蛋白聚集體形成。本研究在重復(fù)其部分研究的過程中顯示，引起核內(nèi)蛋白聚集體形成并非由其保守N端決定，而是由非保守的C端決定。由于所克隆的片段均相同，區(qū)別僅在本課題組采用的真核表達(dá)載體為pEGFP-N1，而Lin et al［3］使用的是pEGFP-C1（本實(shí)驗(yàn)中目的基因位于EGFP N端，對(duì)方實(shí)驗(yàn)中目的基因位于EGFP C端），因此產(chǎn)生了截然相反的結(jié)果。而且通過核定位信號(hào)預(yù)測(cè)也表明pUL76所含有的核定位信號(hào)（205～245aa）位于非保守C端，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)只有pUL76和pUL76非保守C端定位于細(xì)胞核，而pUL76保守N端彌散分布于整個(gè)細(xì)胞。因此非保守的C端與細(xì)胞核內(nèi)蛋白泛素化降解途徑受體S5a相互作用更符合實(shí)際。

HCMV先天性感染主要累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可引起感音神經(jīng)性耳聾、智力發(fā)育遲緩和小頭畸形等。目前，HCMV致神經(jīng)系統(tǒng)病變的確切機(jī)制尚不清楚。本研究通過截短表達(dá)UL76的不同片段，探討pUL76引起細(xì)胞核內(nèi)蛋白聚集體形成的決定序列，從而為進(jìn)一步研究UL76的生物學(xué)功能以及其在HCMV致病中所扮演的角色奠定基礎(chǔ)。

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Unconserved C terminal of pUL76 in human ctomegalovirus elicits aggresome formation

Zhang Wenchang1，Chen Jingxian1，2，Wang Mingli1
（1Dept of Microbiology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Pathology，Columbia University，New York 10032）

AbstractObjective To define the nuclear agrresome formation is determinated by which part of the UL76 of

HCMV．Full-length，conserved N terminal and unconserved C terminal of pUL76 were constructed to eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1．Methods Primers were designed to amplify full-length and different part of pUL76 according to standard sequence of HCMV AD169 which had been submitted to GenBank（FJ527563．1）．These fragments were constructed to eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1．The recombinant plasmids were designated pEGFP-UL76，pEGFP-UL76N，pEGFP-UL76C respectively．Double digestion and sequencing were performed to verify the accuracy of recombinant plasmids construction．Empty vector and three recombinant plasmids were transient transfected to HELF and HepG-2 cells respectively．Reverse transcriptation PCR and Western blot were performed to detect the RNA and protein expression level respectively．Different nuclear aggresome formations were visualized with an Olympus fluorescence microscopy．Results pEGFP-N1 and pEGFP-UL76N were unable to induce nuclear aggresome formation，whereas pEGFP-UL76 and pEGFP-UL76C were able to elicit nuclear aggresome formation．Conclusion The unconserved C terminal of pUL76 is sufficient to induce nuclear aggresome formation．

Key wordshuman cytomegalovirus；UL76；protein aggresome

作者簡(jiǎn)介：張文昌，男，碩士研究生；王明麗，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：mingliwang＠ahmu．edu．cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：30872253）；安徽高校省級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：KJ2012ZD08）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）04－0411－05

中圖分類號(hào)R 349．64