寧寅寬，李 強(qiáng)，蔡偉良，武成聰，陳佳濱，石正松

綠色熒光蛋白標(biāo)記兔BMSCs體外成骨的定量能譜分析

寧寅寬，李 強(qiáng)，蔡偉良，武成聰，陳佳濱，石正松

摘要目的 觀察綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)改變和體外骨生成中礦化鈣結(jié)節(jié)的形成，并結(jié)合掃描電鏡和X射線能譜分析技術(shù)（SEM／EDS）對(duì)礦化鈣結(jié)節(jié)元素進(jìn)行定量能譜分析。方法用攜帶GFP基因的腺病毒轉(zhuǎn)染兔BMSCs進(jìn)行示蹤標(biāo)記，并誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨方向分化，通過(guò)倒置熒光顯微鏡、鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色觀察成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)改變和礦化鈣結(jié)節(jié)的形成，結(jié)合SEM／EDS技術(shù)觀測(cè)礦化鈣結(jié)節(jié)的表面微觀結(jié)構(gòu)及其元素構(gòu)成。結(jié)果 腺病毒介導(dǎo)GFP基因（Ad-GFP）轉(zhuǎn)染兔BMSCs后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)向成骨方向分化，并形成不透光的礦化鈣結(jié)節(jié)，鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色見(jiàn)紅色礦化結(jié)節(jié)，SEM下見(jiàn)礦化鈣結(jié)節(jié)散布于細(xì)胞中，細(xì)胞重疊生長(zhǎng)，分泌基質(zhì)旺盛。EDS分析顯示礦化鈣結(jié)節(jié)主要組成元素與正常骨組織相同，其鈣磷比（Ca／P）為1．55，接近正常骨組織鈣磷比1．49。結(jié)論 Ad-GFP能成功轉(zhuǎn)染并標(biāo)記兔BMSCs，成骨誘導(dǎo)后BMSCs向成骨方向分化，具備較好的骨生成能力，BMSCs體外礦質(zhì)化成骨過(guò)程與體內(nèi)基本相同。

關(guān)鍵詞重組腺病毒；綠色熒光蛋白；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；掃描電鏡；能譜分析

2014－12－31接收

作者單位：桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院四肢創(chuàng)傷手外科，桂林 541001

在觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone-marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）體外誘導(dǎo)成骨時(shí)，一般通過(guò)生物化學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)所培養(yǎng)BMSCs內(nèi)堿性磷酸酶活性，Ⅰ型膠原、成骨特異性蛋白和成骨分化調(diào)控因子的表達(dá)等，但這些生物化學(xué)檢測(cè)方法僅能間接地反映BMSCs體外成骨分化的生物特性，而對(duì)BMSCs體外骨生成的直接觀測(cè)方法較少［1］。綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因標(biāo)記是一種細(xì)胞示蹤技術(shù)，用GFP標(biāo)記BMSCs可直接觀察細(xì)胞的形態(tài)改變和空間分布［2］。該實(shí)驗(yàn)以腺病毒為表達(dá)載體，介導(dǎo)GFP基因標(biāo)記兔BMSCs，在即時(shí)動(dòng)態(tài)觀察成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的同時(shí)，并結(jié)合掃描電鏡和X射線能譜分析（scanning electron microscope and energy dispersive spectrometer，SEM／EDS）技術(shù)直接觀測(cè)BMSCs成骨分化中礦化鈣結(jié)節(jié)的表面微觀結(jié)構(gòu)及其鈣、磷元素含量，定量研究BMSCs體外骨生成中礦化鈣結(jié)節(jié)元素組成。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1 腺病毒載體 Ad-GFP表達(dá)載體由美國(guó)英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司構(gòu)建、鑒定和提供。采用免疫法檢測(cè)腺病毒滴度，病毒滴度為2×1010pfu／ml。

1．1．2 兔BMSCs 本課題組前期實(shí)驗(yàn)已完成了兔

BMSCs的原代獲取、傳代培養(yǎng)及鑒定，并取第5代細(xì)胞液氮凍存?zhèn)溆茫?］。本次實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為第5代凍存細(xì)胞復(fù)蘇后傳代至第10代的BMSCs。

1．1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性成年新西蘭大白兔1只，7月齡，3.5 kg，清潔級(jí)，購(gòu)于桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1．1．4 主要試劑和儀器 低糖DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；維生素C、β-磷酸甘油、地塞米松（韓國(guó)Biosharp公司）；茜素、戊二醛（美國(guó)Sigma公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientifc公司）；生物安全柜（中國(guó)蘇凈安泰公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；場(chǎng)發(fā)射SEM（荷蘭飛利浦公司）；EDS儀（英國(guó)牛津公司）。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 兔BMSCs的復(fù)蘇和傳代培養(yǎng) 將待復(fù)蘇的兔BMSCs凍存管迅速解凍，轉(zhuǎn)移至含有3倍于凍存保護(hù)液體積的L-DMEM離心管中離心，棄上清液，細(xì)胞沉淀中加入5 ml完全培養(yǎng)基，充分吹打細(xì)胞懸液至細(xì)胞分布均勻，以含15%血清的L-DMEM完全培養(yǎng)基（含100 IU／ml青霉素、100 IU／ml鏈霉素）接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞復(fù)蘇24 h后換液。各代BMSCs體外培養(yǎng)至單層細(xì)胞匯合約80%，用0.25%胰蛋白酶消化，行1∶2～3傳代培養(yǎng)，細(xì)胞傳至第10代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2．2 兔BMSCs的轉(zhuǎn)染和成骨誘導(dǎo) 設(shè)置轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（MOI＝100），用重組腺病毒Ad-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后換液。轉(zhuǎn)染后第3天，更換成骨誘導(dǎo)液（含10 nmol／L地塞米松、15 mmol／L維生素C、10 mmol／L β-磷酸甘油、pH 7.3、含15%血清的LDMEM）培養(yǎng)細(xì)胞，以后每3 d更換1次成骨誘導(dǎo)液，培養(yǎng)1周后，更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。在倒置熒光顯微鏡下逐日觀察轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。

1．2．3 鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色觀察鈣化斑的形成 兔BMSCs以1×105個(gè)／孔接種6孔板進(jìn)行細(xì)胞爬片處理，接種前每孔預(yù)先放置已消毒的20 mm蓋玻片。經(jīng)轉(zhuǎn)染及成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后，在倒置顯微鏡下觀察礦化鈣結(jié)節(jié)的形成，并于第21天隨機(jī)細(xì)胞爬片，用PBS漂洗3次，95%乙醇固定10 min，蒸餾水沖洗3次，滴加0．1%茜素紅染液，常溫染色1 h，蒸餾水沖洗，干燥，直接鏡下觀察。

1．2．4 SEM觀察和EDS分析 第21天隨機(jī)取細(xì)胞爬片，用2．5%戊二醛固定，梯度丙酮脫水，真空干燥，噴金鍍膜，在Quanta 200 FEG場(chǎng)發(fā)射環(huán)境SEM和EDS儀上進(jìn)行測(cè)試。在SEM下觀察細(xì)胞及鈣結(jié)節(jié)微表面微觀形貌。然后獲取檢測(cè)微區(qū)，用EDS儀測(cè)定微區(qū)主要元素（C、O、Ca、P）的重量百分比和原子百分比百分含量，重復(fù)3次。能譜儀技術(shù)指標(biāo)：電壓10 kV、電子束6.0、工作距離10.0 mm。取成年新西蘭大白兔髂骨骨皮質(zhì)，經(jīng)同樣方法處理后在相同條件下進(jìn)行觀測(cè)。

2 結(jié)果

2．1 轉(zhuǎn)染及成骨誘導(dǎo)后兔BMSCs形態(tài)學(xué)觀察和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色 腺病毒介導(dǎo)GFP基因轉(zhuǎn)染兔BMSCs（MOI＝100）后，未見(jiàn)細(xì)胞明顯死亡，轉(zhuǎn)染后24 h后即可看到細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，隨著時(shí)間推移熒光表達(dá)漸強(qiáng)，48 h達(dá)到頂峰，轉(zhuǎn)染效率約90%。成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后做不傳代培養(yǎng)，第7天，細(xì)胞增殖較前緩慢，細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形或立方狀；第14天，細(xì)胞熒光表達(dá)較前減弱，細(xì)胞形態(tài)為短梭形、三角形或多角形，旋渦狀排列，胞質(zhì)豐富，內(nèi)有高折射性空泡和深色顆粒，細(xì)胞分泌基質(zhì)。見(jiàn)圖1。隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸變?yōu)槎鄬?，重疊生長(zhǎng)，無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，并形成結(jié)節(jié)狀，最終形成不透光的礦化結(jié)節(jié)；第21天細(xì)胞爬片鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色后為紅色鈣結(jié)節(jié)。見(jiàn)圖2。

2．2 SEM觀察和EDS分析 SEM下見(jiàn)鈣化灶點(diǎn)狀散布于細(xì)胞中，相互連接成小片狀，稍凸出于重疊細(xì)胞層之上，分泌基質(zhì)旺盛，鈣化斑結(jié)構(gòu)疏松、粗糙，呈水泥狀。用EDS分析儀檢測(cè)SEM掃描微區(qū)得出分析圖譜，同時(shí)計(jì)算機(jī)由譜峰強(qiáng)度自動(dòng)換算為所測(cè)主要元素（C、O、Ca、P）的相對(duì)含量。見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)顯示鈣化斑區(qū)鈣磷比（Ca／P）為1.55，接近羥基磷灰石鈣磷比1.67，說(shuō)明鈣化斑塊表面有鈣、磷沉積物產(chǎn)生，可能為磷酸鈣鹽。數(shù)據(jù)顯示正常骨組織鈣磷比1.49，且正常骨組織與鈣化斑內(nèi)主要組成元素相同，均為鈣和磷元素。但是鈣化斑內(nèi)鈣、磷元素含量較正常骨組織低，表現(xiàn)為能譜圖中元素峰覆蓋面積積分值比正常骨組織偏低。鈣化斑區(qū)和正常骨組織分析圖見(jiàn)圖3。

表1　鈣化斑區(qū)和正常骨組織表面元素分析

3 討論

BMSCs能較穩(wěn)定地保持干細(xì)胞特性，有多向分化潛能，能在特定的環(huán)境下分化為成骨細(xì)胞，是骨組織工程中首選種子細(xì)胞。同時(shí)，其體外高增殖能力為多種載體攜帶目的基因的轉(zhuǎn)染奠定了基礎(chǔ)［4］。GFP已成為示蹤目的基因表達(dá)、細(xì)胞蛋白定位和完整活細(xì)胞形態(tài)和空間分布的重要報(bào)告基因，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛［2］。重組腺病毒是一種安全、高效的基因載體，能夠高水平瞬時(shí)表達(dá)外源基因，克隆的細(xì)胞不表達(dá)目的基因［4］。本實(shí)驗(yàn)以腺病毒為表達(dá)載體，介導(dǎo)GFP基因標(biāo)記兔BMSCs，在倒置熒光顯微鏡下直接動(dòng)態(tài)即時(shí)觀察BMSCs的成骨分化過(guò)程中的細(xì)胞形態(tài)改變和空間分布。顯示兔BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖速度開(kāi)始減慢，細(xì)胞形態(tài)向成骨方向分化，細(xì)胞形態(tài)由旋渦狀單層排列的長(zhǎng)梭形、立方狀逐漸變?yōu)槎趟笮?、三角形或多角形。?xì)胞逐漸變?yōu)槎鄬硬⒅丿B生長(zhǎng)，不出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，形成細(xì)胞團(tuán)塊并逐漸增大，最終形成不透光的礦化鈣結(jié)節(jié)。培養(yǎng)至14 d過(guò)程中觀察到綠色熒光表達(dá)較前逐漸減弱，可能是GFP表達(dá)減弱和細(xì)胞大量克隆增殖、重疊生長(zhǎng)的共同結(jié)果。

BMSCs在特定的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)下向成骨方向分化，主要包括地塞米松、β-磷酸甘油、維生素C等。其發(fā)生機(jī)制可能為地塞米松促進(jìn)BMSCs早期調(diào)節(jié)成骨分化基因的表達(dá)，并增強(qiáng)堿性磷酸酶的活性，增加細(xì)胞外膠原基質(zhì)合成，最終在成骨分化后期形成礦化鈣結(jié)節(jié)。β-磷酸甘油為細(xì)胞提供足夠的堿性磷酸酶作用的底物，使生長(zhǎng)環(huán)境中有機(jī)磷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)磷，并加速鈣鹽沉積使細(xì)胞及基質(zhì)骨化，生成礦化鈣結(jié)節(jié)。維生素C誘導(dǎo)BMSCs合成膠原蛋白，使堿性磷酸酶保持較高活性。細(xì)胞外基質(zhì)鈣化及無(wú)機(jī)鈣、磷沉積是BMSCs終末期成骨分化的表現(xiàn)［5－6］。本實(shí)驗(yàn)以地塞米松、β-磷酸甘油、維生素C作為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液體外培養(yǎng)BMSCs，表明BMSCs能形成礦化的細(xì)胞外基質(zhì)，并形成礦化鈣結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色后呈紅色。提示細(xì)胞已經(jīng)向終末期成骨分化。礦化鈣結(jié)節(jié)在SEM下散布于細(xì)胞中，相互連接成片，結(jié)構(gòu)疏松、粗糙。EDS分析數(shù)據(jù)顯示礦化鈣結(jié)節(jié)可能為鈣、磷沉積所形成的磷酸鈣鹽，為類羥基磷灰石。鈣化斑內(nèi)主要組成元素與正常骨組織相同，其鈣磷比接近正常骨組織鈣磷比，可以從鈣磷比變化初步說(shuō)明BMSCs體外礦質(zhì)化成骨過(guò)程與體內(nèi)基本相同。隨著礦化鈣結(jié)節(jié)的改建和骨基質(zhì)中有機(jī)膠原成分的增加，體外所生成骨組織將逐漸趨向成熟，鈣磷比值將恢復(fù)到正常骨組織比值水平［7］。

骨的鈣化是指無(wú)機(jī)鹽有序沉積于有機(jī)質(zhì)內(nèi)的過(guò)程。在骨的鈣化過(guò)程中，細(xì)胞和基質(zhì)發(fā)揮著重要的作用，是成核作用的核心部位，是骨形成的基礎(chǔ)。細(xì)

胞和基質(zhì)成分與羥基磷灰石混合在一起，形成礦化鈣結(jié)節(jié)［7－8］。骨基質(zhì)中有機(jī)質(zhì)90%為Ⅰ型膠原蛋白，無(wú)機(jī)質(zhì)主要為磷酸鈣鹽，以結(jié)晶狀態(tài)沉積于膠原上［9］。實(shí)驗(yàn)［10］證實(shí)BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)液體外培養(yǎng)后，檢測(cè)有Ⅰ型膠原蛋白生成。本實(shí)驗(yàn)在SEM下觀察見(jiàn)細(xì)胞重疊生長(zhǎng)，分泌基質(zhì)旺盛，礦化鈣結(jié)節(jié)散布于細(xì)胞中，相互連接成片。說(shuō)明細(xì)胞通過(guò)分裂增殖后，大量分泌細(xì)胞基質(zhì)，隨后被自身分泌的基質(zhì)所包繞，磷酸鈣鹽沉積在細(xì)胞基質(zhì)局部，最終形成礦化鈣結(jié)節(jié)。再一次證實(shí)成骨誘導(dǎo)BMSCs體外礦質(zhì)化成骨過(guò)程與體內(nèi)基本相同。

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Quantitative energy spectrum analysis on osteogenesis of rabbit bone-marrow mesenchymal stem cells labeled by green fluorescent protein in vitro

Ning Yinkuan，Li Qiang，Cai Weiliang，et al
（Dept of Limb Trauma Surgery，The Affilated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001）

AbstractObjective To observe the morphological changes of rabbit bone-marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）after osteogenic induction and calcified plaque formation of osteogenesis of rabbit BMSCs labeled by green fluorescent protein（GFP）in vitro and quantitatively analyze the elements of calcified plaque by scanning electron microscope and energy dispersive spectrometer（SEM／EDS）．Methods The rabbit BMSCs were traced by adenovirus with GFP（Ad-GFP）gene，and then cells were induced differentiation to osteogenesis．Inverted fluorescence microscope and alizarin red staining were applied to observe morphological changes of cells after transfection and calcified plaque formation and SEM／EDS were employed to study the surface microstructure and element composition of calcified plaque．Results Fluorescence microscope showed rabbit BMSCs after Ad-GFP transfection gave green light and the cell morphology differentiated to osteogenic accompanied with opaque mineralized calcium nodule．Alizarin red staining exhibited red mineralized nodules．From SEM，punctate mineralization calcium nodules scattered among cells and cells grew overlapply strongly secreted matrix．EDS confirmed that the main elements of mineralized calcium nodules were analogous to normal bone tissue and ratio of calcium to phosphorus（Ca／P）was 1.55，close to normal ratio 1.49．Conclusion Rabbit BMSCs can be successfully transfected and labeled by Ad-GFP and trend to osteogenic differentiation after osteogenesis induction．BMSCs have a preferable osteogenic capability and the process of biological mineralization in vitro is the same with in vivo．

Key wordsadenovirus；green fluorescent protein；bone-marrow mesenchymal stem cells；scanning electron microscopy；spectrum analysis

作者簡(jiǎn)介：寧寅寬，男，碩士研究生；李 強(qiáng)，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：li．q12251970＠163．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：31160199）

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）04－0415－04

中圖分類號(hào)R 687．34