王 丹程慶武楊鎮(zhèn)宇連玉喜葉少文劉家壽李鐘杰羅相忠鄒桂偉

(1. 中國水產科學研究院長江水產研究所, 中國水產科學研究院淡水魚類育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室 武漢 430223；2. 武漢市江夏區(qū)國營牛山湖漁場, 武漢 430205； 3. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室,武漢 430072； 4. 中國科學院大學, 北京 100049)

三峽庫區(qū)鲌屬魚類線粒體COⅠ基因遺傳多樣性的初步分析

王 丹1程慶武2楊鎮(zhèn)宇1連玉喜3,4葉少文3劉家壽3李鐘杰3羅相忠1鄒桂偉1

(1. 中國水產科學研究院長江水產研究所, 中國水產科學研究院淡水魚類育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室 武漢 430223；2. 武漢市江夏區(qū)國營牛山湖漁場, 武漢 430205； 3. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室,武漢 430072； 4. 中國科學院大學, 北京 100049)

鲌屬魚類(Culter spp.)隸屬于鯉科(Cyprinidae)、 鲌亞科(Cultrinae), 是東亞特有鯉科魚類的一個重要組成部分,廣泛分布于中國、越南、朝鮮和俄羅斯, 在我國除青藏高原外, 其他各地均有分布[1], 該屬大部分物種都是重要的經(jīng)濟魚類(如 常見的翹嘴 鲌C. alburnus、 蒙古 鲌C. mongolicus、 達氏 鲌C. dabryi等), 同時它們在維持水域生態(tài)平衡中也發(fā)揮著重要作用。近年來, 由于過度捕撈、棲息地改變、水質污染等人為因素影響, 保護 鲌屬魚類的種質資源刻不容緩, 已有學者對 鲌屬不同地理種群的遺傳結構進行了調查評估[2,3], 但主要集中在長江中下游流域,針對長江上游地區(qū)的相關研究少有報道。

線粒體DNA具有分子小、拷貝數(shù)多、編碼效率高、母系遺傳、進化速率快等特點[4], CO Ⅰ(Cytochrome Oxidase subunit Ⅰ)基因是位于線粒體DNA的蛋白質編碼基因, 能夠對大部分物種進行有效鑒定, 并且存在顯著的序列變異, 因而廣泛應用于物種鑒定、群體遺傳學等研究中[5—9]。彭居俐等[5]用COⅠ 基因序列探討了 鲌屬魚類種間的系統(tǒng)發(fā)育關系； 張大莉等[6]用 COⅠ基因序列研究大口黑鱸Micropterus salmoides的遺傳多樣性, 認為大口黑鱸佛羅里達亞種的遺傳多樣性高于北方亞種。

在三峽水庫蓄水后, 庫區(qū)水位升高、水流減緩、泥沙沉積、餌料生物組成變化, 這種條件一般適宜于喜緩流水或靜水生活的魚類(例 如適應范圍較廣的 鲌亞科魚類), 香溪河[10]、大寧河[11]、小江[12]等庫區(qū)典型支流的漁獲物調查結果也表明翹嘴 鲌、蒙古 鲌等在現(xiàn)階段魚類群落中屬于常見種或優(yōu)勢種, 目前有關三峽水庫 鲌屬野生種群的的遺傳結構分析資料還非常缺乏。本研究從CO Ⅰ基因水平上評估三峽庫區(qū)幾個典型支流的 鲌屬魚類遺傳多樣性, 分析不同種群的遺傳結構差異, 以期為合理利用和保護三峽庫區(qū) 鲌屬魚類自然種質資源提供理論依據(jù)和科學參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域

本研究的魚類采樣地點包括三峽水庫湖北省秭歸縣境內的百歲溪、香溪河和童莊河, 重慶市巫山縣境內的大寧河, 以及重慶市云陽縣境內的小江水域(圖1)； 其中百歲溪距離三峽大壩約7 km, 香溪河和童莊河距離大壩約34 km,大寧河和小江河距離大壩分別約124 km和252 km。

1.2 魚類樣品采集

三峽庫區(qū) 鲌屬魚類樣品采集于2013年3—8月進行,沿河岸調查漁民漁獲物情況, 所用網(wǎng)具主要為三層刺網(wǎng),其規(guī)格為網(wǎng)長100 m或150 m, 網(wǎng)高4—20 m, 網(wǎng)目大小3—12 cm 。 鲌屬種類鑒定依照《中國動物志》[1], 調查期間采集到的 鲌屬魚類包括達氏 鲌、蒙古 鲌和翹嘴 鲌, 現(xiàn)場剪下胸鰭條放入 95%乙醇浸泡保存。樣品采集信息見表1, 其中達氏 鲌在大寧河和小江漁獲物中的出現(xiàn)率和相對豐度均很低, 因而造成樣品不足, 蒙古 鲌在香溪河以及翹嘴 鲌在百歲溪和大寧河也存在同樣情況, 鲌屬魚類樣品采集分布情況較大程度上與它們在各研究區(qū)域的資源量現(xiàn)狀相符合。

1.3 基因組DNA提取與檢測

基因組 DNA提取采用經(jīng)典的酚-氯仿法[13]?；蚪MDNA提取后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量, 用紫外分光光度計測定DNA濃度, 置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增及測序

PCR擴增的目的片段是 COⅠ基因靠近 5′末端的長度為 943 bp左右的序列, 其擴增引物為 L5996-COⅠ(5′-CACAAAGACATTGGCACCCT-3′)和 H6855-COⅠ(5′-AGTCAGCTGAAKACTTTTAC-3′)[5]。

圖1 采樣地點分布圖Fig. 1 Geographic map of the sampling sites in the Three Gorges Reservoir

表1 三峽水庫鲌屬魚類樣品采集信息Tab. 1 Sampling information for Culter spp. in the Three Gorges Reservoir

PCR反應條件如下: 94℃預變性 5min； 循環(huán) 35次,包括94℃變性35s, 退火溫度50 ℃ ,退火時間35s, 72℃延伸50s； 最后72℃終延伸10min。

PCR反應體系: 總體積25 μL, 包括大約20 ng總DNA,上、下游引物各1 μL (5 μmol/L), 1 μLdNTP (10 mmol/L), 0.6 U Taq聚合酶(TIANGEN), 2.5 μL緩沖液(含 Mg2+1.5 mmol/L)。

每次PCR反應設立空白對照。擴增產物在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳以檢測有無擴增產物； 電泳后凝膠采用溴化乙錠進行染色, 紫外凝膠掃描系統(tǒng)掃描記錄；PCR產物克隆后測序。引物合成和目的片段測序工作由武漢擎科生物技術有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用 ContigExp軟件對獲得的測序序列進行片段拼接和序列分析； MEGA6軟件計算組內遺傳距離, 分析序列的堿基組成[14]； DnaSP 軟件計算單倍型多樣性(Haplotype diversity, Hd)和核苷酸多態(tài)性(Nucleotide diversity, Pi)[15]。

2 結果

2.1 鲌屬三種魚類COⅠ序列特征及遺傳多樣性

通過PCR 擴增得到三峽庫區(qū)翹嘴 鲌 、蒙古 鲌、達氏鲌的共53個COⅠ擴增帶。獲得CO Ⅰ基因靠5′端一段長度約為943 bp的片段, 編碼314氨基酸。在943個排列位點中, 變異位點 208個, 約占 22.1%； 簡約信息位點(Parsimony informative sites) 71 個, 單一多態(tài)位點(Singleton variable sites) 137個。單倍型共有42個, 每個群體的單倍型和獨有單倍型數(shù)見表2。

三峽庫區(qū)三種 鲌魚的單倍型多樣性為 0.9869±0.007,核苷酸多態(tài)性為 0.0301±0.0042。單倍型多樣性范圍為0.8667—1, 核苷酸多態(tài)性范圍為 0.0022—0.0715(表 2),達氏 鲌群體遺傳多樣性高低排序為大寧河＞童莊河＞香溪河, 小江蒙古 鲌群體的遺傳多樣性大于香溪河群體, 翹嘴 鲌小江群體遺傳多樣性顯著大于香溪河群體。

2.2 鲌屬三種魚類堿基組成

如表3所示, 三峽庫區(qū) 鲌屬三種魚類的T、C、A、G堿基平均含量分別為 28.4%、26.7%、26.3%、18.6%, 其中A+T含量(54.7%)明顯高于G+C含量(45.3%)。G+C含量排列順序由高到低依次為蒙古 鲌(46.3%)、 翹嘴鲌(45.2%)和 達氏 鲌(45%)。

2.3 鲌屬三種魚類的遺傳距離

三峽庫區(qū)三種 鲌屬魚類兩兩比較的種間平均遺傳距離見表4, 蒙古 鲌 和達氏 鲌的種間距離最大(0.0458), 蒙古 鲌和翹嘴 鲌的種間距離最小(0.0378), 鲌屬三種魚類的平均遺傳距離為0.0314。

由表4和5可知, 達氏 鲌的種內平均遺傳距離為0.0116, 種內遺傳距離最大為 0.0412, 發(fā)生在童莊河和大寧河間； 最小種內遺傳距離發(fā)生在小江和香溪河間, 其值為0.0020 。翹嘴 鲌的種內平均遺傳距離為0.0230, 其中遺傳距離最大為 0.1515, 發(fā)生在大寧河和香溪河群體間；最小遺傳距離為0.0095, 發(fā)生在小江和香溪河群體間。蒙古 鲌的種內平均遺傳距離為 0.0230, 小江和香溪河群體間遺傳距離為0.0029。

表2 三峽庫區(qū)鲌屬三種魚類的單倍型多樣性和核苷酸多樣性Tab. 2 Haplotype diversity and nucleotide diversity of Culter spp. in the Three Gorges Reservoir

表3 三峽庫區(qū)三種鲌屬魚類COⅠ堿基組成Tab. 3 Composition of nucleotide of Culter spp. in the Three Gorges Reservoir

表4 三峽庫區(qū)三種鲌屬魚類兩兩比對的種間平均遺傳距離和種內遺傳距離Tab. 4 Genetic distance within species and pairwise distance between Culter spp. in the Three Gorges Reservoir

表5 三峽庫區(qū)三種鲌屬魚類組間遺傳距離Tab. 5 The genetic distance between groups of Culter spp. in Three Gorges Reservoir

3 討論

鲌屬魚類是東亞特有鯉科魚類中較為重要的一個類群, 經(jīng)歷了相同的短時間物種暴發(fā)過程。作為一群快速分化的物種, 其基因序列的變異度相對較小[16]。在本研究中,三峽庫區(qū)53 條 鲌屬魚類線粒體DNA序列中變異位點208個, 約占22.1%。從堿基組成上來看, T、C、A、G各個堿基所占百分比分別為28.4%、26.7%、26.3%和18.6%。平均 G+C含量為 45.3%, 這與彭居俐等[5]的研究結果(45.6%)相似, 表現(xiàn)出明顯的A+T偏倚性。核苷酸堿基構成的偏倚是線粒體蛋白質編碼基因的一個顯著特征, 與脊椎動物線粒體DNA的特點是一致的[17]。

從單倍型數(shù)據(jù)來看, 本研究共測序 53個樣品, 單倍型數(shù)目高達 42個, 各群體的單倍型數(shù)目很高, 擁有較多的獨有單倍型, 僅少數(shù)個體共享單倍型, 反映了三峽庫區(qū) 鲌屬魚類整體比較保守。檢測到獨有單倍型最多的 3個群體分別是翹嘴 鲌小江群體、達氏 鲌香溪河群體和翹嘴鲌香溪河群體?？赡芟阆雍托〗貐^(qū)的 鲌屬魚類具有更高的遺傳多樣性。

種間和種內遺傳距離的大小是進行物種鑒別的主要標準。Hebert等[4]對動物界11個門、13320個物種的研究結果顯示, 種內遺傳距離大多數(shù)在 1% 以下, 很少超過2%。比較群體間的遺傳距離, 三峽庫區(qū) 鲌屬三種魚類平均遺傳距離為 0.0314, 顯著大于種間鑒定的最小遺傳距離2% 。達氏 鲌 、蒙古 鲌 和翹嘴 鲌的種內平均遺傳距離分別是0.0116、0.0031和0.0230, 種間遺傳距離大于種內平均遺傳距離, 均符合Hebert等[4]的結論。

單倍型多樣度(Hd)和核苷酸多樣度(Pi)是評價一個群體mtDNA變異程度的主要指標, H和Pi值越大, 表明群體的遺傳多樣性越豐富。核苷酸多態(tài)性考慮各種mtDNA單倍型在群體中所占的比例, 反映的群體mtDNA多態(tài)程度更為精確。本研究結果表明, 基于線粒體 COⅠ基因序列, 鲌

三峽庫區(qū)的 屬魚類具有很高的核苷酸多態(tài)性0.0301 (Pi＞0.005)和較高的單倍型多樣性 0.9869(Hd＞0.8),這一結果高于鮭科魚類[8]和細鱗斜頜鲴 Xenocypris microlepis[9]。

綜上所述, 鲌三峽庫區(qū) 屬魚類具有較高的遺傳多樣性, 不同地理群體享有較多的特有單倍型, 可能蘊藏著較大的進化潛能和更豐富的種質資源, 后續(xù)研究將考慮增加樣品數(shù)量和采集點, 鲌全面評估三峽庫區(qū) 屬魚類的種質狀況和遺傳結構。

[1] Chen Y Y, Fauna Sinica·Osteichthyes·Cypriniformes II [M]. Beijing: Sciences Press. 1998, 185—197 [陳宜瑜. 中國動物志·硬骨魚綱·鯉形目(中卷). 北京: 科學出版社. 1998,185—197]

[2] Wang W, Chen L Q, Yu N, et al. Assessment of genetic diversity of topmouth culter Culter alburnus populations by CO Ⅱ sequences [J].Journal of Dalian Fisheries University, 2008, 23(5): 403—408 [王偉, 陳立僑, 禹娜, 等. 應用COⅡ基因部分序列分析翹嘴 鲌群體的遺傳多樣性. 大連水產學院學報, 2008, 23(5): 403—408]

[3] Yang T Y, Chen H X, Liu X Q, et al. Genetic diversity of Erythroculter ilishaeformis from Danjiangkou Reservoir revealed by RAPD and ISSR analysis [J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2008, 39(3): 240—244 [楊太有, 陳宏喜,劉向奇, 等. 丹江口水庫翹嘴鲌(Erythroculter ilishaeformis)遺傳多樣性的 RAPD和 ISSR分析. 海洋與湖沼, 2008, 39(3): 240—244]

[4] Hebert P D N, Ratnasingham S, deWaard U R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidsse subunit 1 divergences among closely related species [J]. Proceeding of the Royal Society of London B: Biological Science, 2003, 270(suppl. 1): 96—99

[5] Peng J L, Wang X Z, Wang D, et al. Application of DNA barcoding based on the mitochondrial CO I gene sequences in classification of Culter (Pisces: Cyprinidae) [J]. Acta Hydrobiologyica Sinica, 2009, 33(2): 271—276 [彭居麗, 王緒禎, 王丁, 等. 基于線粒體COⅠ基因序列的DNA條形碼在鯉科鲌 屬魚類物種鑒定中的應用. 水生生物學報, 2009, 33(2): 271—276]

[6] Zhang D L, Dong S, Bai J J, et al. Sequence analysis of mtDNA COⅠ region in northern and Florida subspecies of largemouth bass Micropterus salmoides [J]. Journal of Dalian Fisheries University, 2014, 29(3): 212—216 [張大莉,董仕, 白俊杰, 等. 大口黑鱸北方亞種和佛羅里達亞種mtDNA COⅠ序列的分析. 大連海洋大學學報, 2014, 29(3): 212—216]

[7] Liu S F, Chen L L, Dai F Q, et al. Application of DNA barcoding gene COⅠ for classifying family Sciaenidae [J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2010, 41(2): 223—232 [柳淑芳, 陳亮亮, 戴芳群, 等, 基于線粒體 COⅠ基因的DNA 條形碼在石首魚科(Sciaenidae)魚類系統(tǒng)分類中的應用. 海洋與湖沼, 2010, 41(2): 223—232]

[8] Li F G, Zou S M. Genetic diversity analysis of Salmo truttafario based on COⅠ and COⅡ [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2014, 42(23): 7710—7713 [李福貴, 鄒曙明. 亞東鮭線粒體COⅠ與COⅡ基因遺傳多樣性分析.安徽農業(yè)科學, 2014, 42(23): 7710—7713]

[9] Qiao D L, He X M, Wei C B, et al. Genetic variation of mtDNA COⅡ gene in three populations of Xenocypris microlepis [J]. Freshwater Fisheries, 2011, 41(5): 17—21 [喬德亮, 何曉梅, 韋傳寶, 等. 細鱗斜頜鲴三個群體線粒體COⅡ基因的遺傳變異. 淡水漁業(yè), 2011, 41(5): 17—21]

[10] Zhao S S, Ye S W, Xie S G, et al. The current situation of fishery resources and fisheries management strategies in the Xiangxi River of The Three Gorges Reservoir [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(5): 973—982 [趙莎莎, 葉少文, 謝松光, 等. 三峽水庫香溪河魚類資源現(xiàn)狀及漁業(yè)管理. 水生生物學報, 2015, 39(5): 973—982]

[11] Yang F, Yao W Z, Deng H T, et al. The current situation of fish resources in the Daning River after the impoundment of the Three Gorges Reservoir [J]. Freshwater Fisheries, 2013, 43(4): 51—57 [楊峰, 姚維志, 鄧華堂, 等. 三峽庫區(qū)蓄水后大寧河魚類資源現(xiàn)狀研究. 淡水漁業(yè), 2013, 43(4): 51—57]

[12] Li B, Jiang X, Wang Z, et al. The current situation of fishery resources in the Xiaojiang River of the Three Gorges Reservoir [J]. Freshwater Fisheries, 2011, 41(6): 37—42 [李斌,江星, 王志堅, 等. 三峽庫區(qū)蓄水后小江魚類資源現(xiàn)狀.淡水漁業(yè), 2011, 41(6): 37—42]

[13] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual [M]. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989

[14] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J]. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30: 2725—2729

[15] Librado P, Rozas J. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data [J]. Bioinformatics, 2009, 25: 1451—1452

[16] He S P, Liu H, Chen Y Y, et al. Molecular phylogenetic relationships of Eastern Asian Cyprinidse (Pisces: Cypriniformes) inferred from cytochrome b sequences [J]. Science in China, 2004, 47: 130—138

[17] Xiao W H, Zhang Y P. Genetics and evolution of mitochondrial DNA in fish [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2000, 24(4): 384—391 [肖武漢, 張亞平. 魚類線粒體DNA 的遺傳與進化. 水生生物學報, 2000, 24(4): 384—391]

PRELIMINARY ANALYSIS ON THE MTDNA COⅠ GENETIC DIVERSITY OF CULTER SPP. (CYPRINIDAE) IN THE THREE GORGES RESERVOIR

WANG Dan1, CHENG Qing-Wu2, YANG Zhen-Yu1, LIAN Yu-Xi3,4, YE Shao-Wen3, LIU Jia-Shou3, LI Zhong-Jie3, LUO Xiang-Zhong1and ZHOU Gui-Wei1
(1. Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China； 2. NiuShan Lake Farm of Jiangxia District, Wuhan 430205, China； 3. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China； 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

三峽水庫； 鲌屬； COⅠ基因； 遺傳多樣性

Three Gorge Reservoir； Culter spp.； CO Ⅰgene； Genetic Diversity

Q347

A

1000-3207(2015)05-1054-05

10.7541/2015.138

2015-03-26；

2015-05-05

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金(2015JBFM39)； 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室(2014FB16)；農業(yè)部淡水水產生物技術與遺傳育種重點實驗室(FBB2014-02)； 農業(yè)部熱帶亞熱帶水產資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室開放課題資助

王丹(1980—), 女, 湖北武漢人； 博士； 助理研究員； 研究方向為魚類遺傳學。E-mail: wangdan@yfi.ac.cn

鄒桂偉, E-mail: zougw@yfi.ac.cn