杜碧瑩

（廣東省廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510160）

高效液相色譜法測(cè)定注射用己酮可可堿中有關(guān)物質(zhì)

杜碧瑩

（廣東省廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510160）

目的建立測(cè)定注射用己酮可可堿中有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse plus C8柱（250 mm× 4．6 mm，5 m），流動(dòng)相A為甲醇-0．544%磷酸二氫鉀溶液（3∶7），流動(dòng)相B為甲醇-0．544%磷酸二氫鉀溶液（7∶3）梯度洗脫，流速為1．0 mL／min，，檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm。結(jié)果己酮可可堿與各雜質(zhì)分離良好，與可可堿、茶堿、咖啡因在質(zhì)量濃度0．4～5．0 g／mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，定量限分別為8．5，11．1，28．8，12．6 ng。結(jié)論該法專屬性強(qiáng)、靈敏、準(zhǔn)確，可用于注射用己酮可可堿有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

注射用己酮可可堿；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜法

甲基黃嘌呤衍生物己酮可可堿是外周血管抗張劑，可降低外周阻力，改善腦和四肢的血液循環(huán)，已作為血管抗張劑用于各種血管性疾病的治療[1-2]。同時(shí)，己酮可可堿為磷酸二酯酶抑制藥，能增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平，具有免疫調(diào)節(jié)和抗纖維化等藥理作用[3]。注射用己酮可可堿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在國(guó)外藥典及2010年版《中國(guó)藥典》中均無(wú)收載，且注射用己酮可可堿的有關(guān)物質(zhì)檢查采用高效液相色譜(HPLC)法，但檢查方法均不完善[4-5]。本研究中對(duì)注射用己酮可可堿的已知有關(guān)物質(zhì)（可可堿、茶堿、咖啡因與己酮可可堿）在色譜系統(tǒng)中做了有效分離，建立通過(guò)外標(biāo)法控制已知有關(guān)物質(zhì)，不加校正因子的主成分自身稀釋法控制未知有關(guān)物質(zhì)，方法靈敏度高，可有效控制其產(chǎn)品質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

日本島津LC-10AT型高效液相色譜儀（帶DAD檢測(cè)器）；Agilent 1200型高效液相色譜儀?？煽蓧A（批號(hào)為 101110-201001，純度為99．9%）、茶堿（批號(hào)為100121-201104，純度為100．0%）、咖啡因（批號(hào)為171015-201010，純度為100．0%）、己酮可可堿（批號(hào)為100591-200501，純度為100．0%）對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；注射用己酮可可堿（廣東陽(yáng)江制藥有限公司，批號(hào)為 130703 1）；甲醇（色譜純，Merck公司），水為Millipore超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse plus C8柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為0．544%磷酸二氫鉀溶液-甲醇（7∶3）；流動(dòng)相B為0．544%磷酸二氫鉀溶液-甲醇（3∶7），梯度洗脫，0～6 min時(shí) B為 14%，6～13 min時(shí) B 14%→90%，13～30 min時(shí) B為90%，30～38 min時(shí)B 90%→14%，38～43 min時(shí)B為14%；流速：1．0 mL／min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：272 nm；進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果各組分出峰順序依次為可可堿、茶堿、咖啡因與己酮可可堿。己酮可可堿的保留時(shí)間約12 min，茶堿峰與咖啡因峰的分離度為4，咖啡因峰與己酮可可堿峰的分離度為23。色譜見(jiàn)圖1。

2．2 溶液制備

取可可堿、茶堿、咖啡因與己酮可可堿對(duì)照品各適量，精密稱定，加溶劑[0．544%磷酸二氫鉀溶液-甲醇（1∶1）混合液]溶解并定量稀釋制成每1 mL中各含2 μg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。取本品，精密稱定，加溶劑定量稀釋制成每1 mL中約含己酮可可堿1 mg的溶液，即得供試品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

破壞試驗(yàn)：為考察己酮可可堿可能的降解產(chǎn)物及色譜條件的選擇性，采用酸、堿、紫外光照及氧化對(duì)己酮可可堿進(jìn)行破壞性處理。結(jié)果表明，己酮可可堿對(duì)堿、氧化劑較不穩(wěn)定，出現(xiàn)了明顯的雜質(zhì)峰，但與主峰均有良好的分離。色譜圖見(jiàn)圖2。

檢測(cè)波長(zhǎng)確定：用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)上述破壞性試驗(yàn)樣品的檢測(cè)表明，己酮可可堿降解產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)約為272nm，見(jiàn)表1。

圖1 含量測(cè)定高效液相色譜圖

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖

表1 破壞性試驗(yàn)結(jié)果

線性關(guān)系考察：取可可堿、茶堿、咖啡因及己酮可可堿對(duì)照品適量，分別制成每1 mL中各含0．4～5．0 μg的溶液進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(X)為橫坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為 Y=0．000 015 534 7 X-0．014 976 5（r=0．999 99，n=6）；Y=0．000 015 185 8 X+0．002 733 1（r=0．999 98，n=6）；Y=0．000 017 248 5 X+0．018 274 2（r=0．999 99，n=6）；Y=0．000 024 759 6 X+0．045 660 6（r=0．999 97，n=6）。結(jié)果表明，可可堿、茶堿、咖啡因及己酮可可堿質(zhì)量濃度在0．4～5．0 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取系統(tǒng)適用性溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果可可堿、茶堿、咖啡因及己酮可可堿峰面積變化的 RSD分別為0．30，0．20，0．40和0．40（n=6），表明儀器精密度良好。

定量限確定：按信噪比（S／N）為10∶1計(jì)，可可堿、茶堿、咖啡因與已酮可可堿定量限分別為8．50，11．10，28．80，12．60 ng。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品，依法制備6份供試品溶液并測(cè)定含量。結(jié)果的 RSD為1．30%（n=6），表明方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品適量，依法制備供試品溶液，于0，2，6，10，24 h時(shí)取樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD為1．80%（n=5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2．4 有關(guān)物質(zhì)檢查

結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇時(shí)，由合成工藝可見(jiàn)，可可堿為反應(yīng)原料，茶堿則為可可堿的同分異構(gòu)體。利用DAD掃描190～400 nm測(cè)定并提取各色譜紫外分光色譜（UV）圖。結(jié)果顯示，選擇272 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，己酮可可堿、可可堿、茶堿、咖啡因與弱極性的聚合物等合成帶來(lái)的雜質(zhì)及貨架期的降解產(chǎn)物均可檢測(cè)。

表2 有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果（%）

國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下，采用甲醇-水-醋酸（32∶68∶0．5）作為流動(dòng)相，等度洗脫，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍。對(duì)已知有關(guān)物質(zhì)及其余單個(gè)有關(guān)物質(zhì)沒(méi)有明確的規(guī)定，只計(jì)算總有關(guān)物質(zhì)的量（1．0%）。從樣品檢測(cè)對(duì)比結(jié)果來(lái)看，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢出雜質(zhì)的個(gè)數(shù)少，雜質(zhì)總量只有0．08%。該法有關(guān)物質(zhì)的限度修訂為已知雜質(zhì)可可堿、茶堿與咖啡因按外標(biāo)法計(jì)算。由表2可見(jiàn)，有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果均不大于0．2%，其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不大于對(duì)照品溶液中己酮可可堿的峰面積（0．2%），雜質(zhì)總量不過(guò)1．0%。

比較了3個(gè)不同牌號(hào)色譜柱，以柱效、主峰的保留時(shí)間、對(duì)樣品雜質(zhì)的分離效能等綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)，色譜柱均適用。該法專屬性強(qiáng)，己酮可可堿與各雜質(zhì)峰的分離度均符合要求，可更好的控制產(chǎn)品的質(zhì)量。該法專屬性強(qiáng)、靈敏、準(zhǔn)確，可用于注射用己酮可可堿有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

[1]楊麗紅．己酮可可堿治療急性腦梗塞 58例[J]．中國(guó)藥業(yè)，2007，16（1）：58．

[2]郝 嘉，郭 紅，肖穎彬．己酮可可堿的藥理特性和臨床新用途[J]．中國(guó)新藥與臨床雜志，2002，21（3）：183-186．

[3]張?jiān)~俠，張桂林，李志勇，等．己酮可可堿的藥理特性和治療用途的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2008（1）：74-77．

[4]WS1-（X-106）-2005-2006Z．國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S]．

[5]尹德忠，吳耀國(guó)，趙紅俠．注射用己酮可可堿中己酮可可堿含量及有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法測(cè)定 [J]．分析儀器，2007(4)：54-57．

Determination of Related Substances in Pentoxifylline for Injection by HPLC

Du Biying
(Guangzhou Institute for Drug Control,Guangzhou,Guangdong,China 510160)

Objective To establish an HPLC gradient elution method for the determination of related substances in pentoxifylline for injection．M ethods Agilent Zorbax Eclipse plus C8column (250 mm×4．6 mm,5 μm)was used,the methanol-0．544% solution of potassium dihydrogen phosphate(3∶7)as mobile phase A,and a mixture of methanol-0．544% solution of potassium dihydrogen phosphate-(7∶3)as mobile phase B．The detection wavelength was 272 nm and the flow rate 1．0 mL／min for the gradient elute．Results Pentoxifylline and its related substances can be separated effectively by this method．The concentration-response relationship was linear over the range of 0．4-5．0 μg／mL and the limit of detection were 8．5,11．1,28．8,12．6 ng．Conclusion The HPLC method is specific,accurate and sensitive which may be used for the inspection of related substances in pentoxifylline for injection．

Pentoxifylline for Injection;related substances;HPLC

R927.2；R972+.4

A

1006-4931(2015)21-0123-03

杜碧瑩，碩士研究生，副主任藥師，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)藥品檢驗(yàn)，(電子信箱)winddby＠tom．com。

2014-11-13；

2015-04-24)