馬　珅(天津市口腔醫(yī)院牙體牙髓一科，天津　300041)

β-蛻皮甾酮對實驗性牙周炎大鼠癥狀及氧化應(yīng)激的改善作用

馬珅
(天津市口腔醫(yī)院牙體牙髓一科，天津300041)

〔摘要〕目的探討β-蛻皮甾酮(EDS)對實驗性牙周炎大鼠癥狀及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的改善作用。方法選取雄性SD大鼠(260～280 g)采用物理機械刺激法制備實驗性牙周炎大鼠模型。將45只成功誘導(dǎo)的牙周炎大鼠模型隨機分組(n = 15) :高劑量EDS(EDS-H)組、低劑量EDS (EDS-L)組及生理鹽水(NS)組。EDS-H組與EDS-L組分別腹腔注射20 mg·kg－1·d－1或40 mg·kg－1·d－1EDS;同時選取15只同周齡正常大鼠作對照(C)，NS組和C組均腹腔注射等體積生理鹽水。于EDS腹腔注射前后分析各組的牙齦指數(shù)(GI)和附著水平(AL)來評價癥狀改善情況;采用試劑盒檢測牙齦組織丙二醛(MDA)、過氧化氫脂質(zhì)(LPO)水平及過氧化氫酶(CAT)活性;酶聯(lián)免疫吸附法檢測牙齦組織中前列腺素(PG) E2和腫瘤壞死因子(TNF) -α及齦溝液中白介素(IL) -6水平;熒光探針DHE染色法及熒光免疫組化法檢測牙齦組織中活性氧自由基(ROS)和基金金屬蛋白(MMP) 2的表達(dá)情況。結(jié)果與C組相比，NS組的GI和AL、牙齦組織MDA、LPO、PGE2、TNF-α、ROS和MMP2的IOD水平及齦溝液中IL-6水平均升高，CAT活性降低(均P＜0.05) ;給予腹腔注射EDS可改善牙周炎大鼠的以上異常指標(biāo)(P＜0.05)，EDS-H組、EDS-L組與C組的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) ;且EDS-H組的以上指標(biāo)均優(yōu)于EDS-L組(P＜0.05)。結(jié)論EDS對實驗性牙周炎大鼠的癥狀有較好的治療效果，同時對牙齦氧化應(yīng)激、MMP2表達(dá)及炎癥反應(yīng)均有較顯著的改善作用。

〔關(guān)鍵詞〕β-蛻皮甾酮;牙周炎;癥狀;氧化應(yīng)激

第一作者:馬珅(1981-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事牙本質(zhì)粘接材料研究。

牙周疾病作為一種慢性炎癥，牙周炎病灶周圍的牙齦組織內(nèi)可檢測到炎癥因子及細(xì)胞的大量聚集，多種緩解炎癥反應(yīng)的措施可起到較好效果〔1〕。此外，氧化應(yīng)激在牙周炎發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用，故對于牙周炎應(yīng)采用緩解炎癥反應(yīng)和改善氧化應(yīng)激的綜合手段。β-蛻皮甾酮(EDS)是一種類固醇激素，已證實有多種生物活性，如清除自由基、抗氧化、緩解炎癥反應(yīng)及改善胰島素抵抗等〔2～4〕。推測EDS對牙周病的防治也有一定效果。本研究采用EDS腹腔注射治療實驗性牙周炎大鼠，觀察對其癥狀及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響。

1　材料與方法

1.1試劑與主要儀器EDS購自上海歷鼎生物技術(shù)有限公司，Triton X-100、Tris-HCl購自美國Sigma公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購自美國Pierce公司，前列腺素(PG) E2、腫瘤壞死因子(TNF) -αElisa試劑盒購自南京建成生物工程研究所，白介素(IL) -6 Elisa試劑盒購自凱基生物公司，過氧化氫酶(CAT)活性試劑盒購自南京建成公司，丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)試劑盒均購自美國Cayman Chemical公司，綠色標(biāo)記的二抗購自上海亨代勞生物有限公司。儀器: 5424R小型臺式冷凍離心機購自德國Eppendorf公司; Exl 800型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司; Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2動物與分組選取雄性SD大鼠(260～280 g)采用物理機械刺激法制備實驗性牙周炎大鼠模型，將45只成功誘導(dǎo)的牙周炎大鼠模型隨機分組(n=15) :高劑量EDS(EDS-H)組、低劑量EDS(EDS-L)組及生理鹽水(NS)組。EDS-H組與EDS-L組分別腹腔注射20 mg·kg－1·d－1或40 mg·kg－1·d－1EDS。同時選取15只同周齡正常大鼠作對照(C)，NS組和C組均腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3牙周炎模型制備采用水合氯醛麻醉，待充分麻醉后行物理機械刺激法制備牙周炎大鼠模型，借助牙鉆于上頜第一磨牙牙頸處鉆溝，直徑0.3 mm正畸鋼絲結(jié)扎牢固，連續(xù)2 d每天用沾滿牙周致病菌菌液的海綿涂抹該牙，當(dāng)牙齦出現(xiàn)膿腫及牙周膿腫時則造模成功〔5〕。

1.4癥狀評價分別于腹腔注射前(0 w)、注射后2、4、6、8 w測量牙齦指數(shù)(GI)和附著水平(AL)來評價癥狀改善情況。根據(jù)牙齦的炎癥及水腫情況將GI分為4級:牙齦健康無水腫，0 分;牙齦出現(xiàn)輕度炎癥反應(yīng)、顏色改變及輕度水腫，但探查時未見出血，1分;牙齦出現(xiàn)中等炎癥反應(yīng)、顏色發(fā)紅及水腫明顯且探診時出血，2分;牙齦出現(xiàn)嚴(yán)重炎癥反應(yīng)及潰瘍且有自動出血傾向，3分。

1.5相關(guān)指標(biāo)檢測治療8 w后取牙齦組織及齦溝液，冰上裂解組織后，5 000 r/min離心5 min后保留上清，采用試劑盒檢測牙齦組織丙二醛(MDA)、過氧化氫脂質(zhì)(LPO)水平及過氧化氫酶(CAT)活性;酶聯(lián)免疫吸附法檢測牙齦組織中PGE2和TNF-α及齦溝液中IL-6水平;以上操作均嚴(yán)格遵守試劑盒說明書。

1.6熒光探針DHE染色法取出新鮮牙齦組織，取中部冠狀切面進(jìn)行石蠟包埋，切成5 μm厚，加入特異性熒光探針DHE染色，避光反應(yīng)15 min后，采用熒光顯微鏡觀察，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定熒光積分光密度(IOD)。

1.7熒光免疫組化將1.6中制備的牙齦冠狀冰凍切片，經(jīng)H2O2室溫孵育及山羊血清封閉后，滴加MMP2一抗(稀釋度: 1∶100)，4℃孵育過夜后，滴加綠色標(biāo)記的二抗，熒光顯微鏡下觀察，用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定IOD。

2　結(jié)果

2.1各組不同治療時間的癥狀比較與C組比較，其余3組各觀察點GI和AL水平升高(P＜0.05) ; EDS-H組、EDS-L組治療2～8 w的GI和AL水平均低于NS組(P＜0.05)，且EDS-H組治療2～8 w的后的GI和AL水平均低于QNP-L組(P＜0.05)。見圖1。

圖1　各組治療不同時間的癥狀比較

2.2各組氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平比較與C組比較，其余3組的MDA和LPO水平均較高，CAT活性較低(P＜0.05) ; EDS-H組、EDS-L組治療后以上指標(biāo)均優(yōu)于NS組(P＜0.05)，且EDS-H組對MDA、LPO水平及CAT活性的改善程度強于EDSL組(P＜0.05)。見表1。

表1　治療8 w后牙齦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平(±s)

表1　治療8 w后牙齦組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)水平(±s)

與C組比較: 1) P＜0.05;與NS組比較: 2) P＜0.05;與EDS-L組比較: 3) P＜0.05，下表同

組別　n　 MDA(μg/g)　 LPO(μg/g)　 CAT(U/g) C組　15　 3.13±0.56　 6.28±1.26　 35.51±2.74 NS組　10　 17.38±2.691)　24.42±2.641)　9.94±1.451)EDS-L組　10　 12.25±1.371) 2)　19.28±1.571) 2)　18.13±1.271) 2)EDS-H組　10 7.66±1.421) 2) 3)15.42±1.831) 2) 3)27.92±2.361) 2) 3)

2.3各組炎癥相關(guān)因子水平比較與C組比較，其余3組牙齦組織PGE2和TNF-α水平及齦溝液中IL-6水平均較高(P＜0.05) ; EDS-H組、EDS-L組治療后以上指標(biāo)均優(yōu)于NS組(P＜0.05)，且EDS-H組對PGE2、TNF-α及IL-6水平的改善程度強于EDS-L組(P＜0.05)。見表2。

表2　治療4 w后牙齦組織及齦溝液中炎癥相關(guān)因子水平(±s)

表2　治療4 w后牙齦組織及齦溝液中炎癥相關(guān)因子水平(±s)

組別　n　 PGE2(μg/g)　 TNF-α(ng/g)　 IL-6(μg/L) C組　15　 3.45±0.56　 12.54±1.10　 4.11±0.72 NS組　10　 12.27±2.571)　29.71±2.671)　16.72±2.411)EDS-L組　10　 10.09±2.191) 2)　22.82±1.771) 2)　12.59±1.261) 2)EDS-H組　10　 7.31±1.641) 2) 3)17.42±2.061) 2) 3)9.64±1.241) 2) 3)

2.4各組牙齦組織ROS、MMP2水平比較與C組比較，其余3組牙齦組織ROS、MMP2水平較高(P＜0.05) ; EDS-H組、EDSL組治療后ROS、MMP2水平均低于NS組(P＜0.05)，且EDS-H組低于EDS-L組(P＜0.05)。見表3，圖2，圖3。

表3　兩組治療8 w后牙齦組織中ROS和MMP2水平(±s)

表3　兩組治療8 w后牙齦組織中ROS和MMP2水平(±s)

組別　n　ROS　MMP2 C組　15　 54.87±9.18　68.56±12.53 NS組　10　 241.66±29.621)　345.92±34.601)EDS-L組　10　 157.41±24.731) 2)　227.54±25.621) 2)EDS-H組　10　 113.35±15.851) 2) 3)　156.19±22.481) 2) 3)

圖3　治療8 w后牙齦組織MMP2染色情況(×400)

3　討論

牙周炎發(fā)病率高，通常伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)〔6〕，盡管具體機制尚不明確，但革蘭陰性厭氧菌為主要致病菌，而有研究指出致病菌通過炎癥因子引發(fā)機體免疫應(yīng)答，損傷牙周組織，如不及時有效干預(yù)，可導(dǎo)致牙齒喪失，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。臨床研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者伴有嚴(yán)重的高炎癥反應(yīng)狀態(tài)，且建議用炎癥反應(yīng)來判斷病情嚴(yán)重程度和預(yù)測預(yù)后〔7，8〕;同時炎癥反應(yīng)引發(fā)的氧化應(yīng)激在該病發(fā)生發(fā)展中也起到了一定作用〔9〕。故總體上改善炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是牙周炎治療的根本措施。

EDS是廣泛存在的一種類固醇激素，不僅可主導(dǎo)昆蟲的多種生理過程，如生殖、蛻皮及變態(tài)等，同樣也可調(diào)控脊椎動物的能量代謝、調(diào)節(jié)免疫及抗氧化應(yīng)激等。吳霞等〔10〕的研究發(fā)現(xiàn)其可通過抑制炎癥反應(yīng)來發(fā)揮對急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用，顯示其具有顯著的抗炎功效。鑒于炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是牙周炎的重要表現(xiàn)，因此推測EDS可用于牙周炎的防治。

本研究發(fā)現(xiàn)EDS對牙周炎癥狀有較好的緩解作用。此外，本研究進(jìn)一步提示EDS可作為緩解牙周病的理想用藥。目前，EDS可從植物中提取出來，且多項研究證實EDS可安全應(yīng)用于脊椎動物中〔11〕，因此顯示出其具有的應(yīng)用前景。

本研究表明牙周炎大鼠中存在顯著炎癥反應(yīng)，亦證實了牙周炎大鼠模型的成功制備。而EDS腹腔注射8 w后，提示EDS對牙周炎的炎癥反應(yīng)亦有較好的緩解效果，即便在較低劑量下也可觀察到顯著效果;但高劑量的以上3指標(biāo)水平仍與正常大鼠有差異，可能與觀察時間短和EDS劑量不足有關(guān)，下一步將增加EDS用量。MMP2參與了牙周炎對牙周組織的炎癥破壞，MMP2在健康牙齦中表達(dá)較弱，而在牙周炎患者的牙齦組織中高表達(dá)。本研究進(jìn)一步表明EDS對炎癥反應(yīng)的改善確切有效。

本研究表明牙周炎大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著。EDS腹腔注射8 w后，表明EDS可改善牙周炎大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)EDS對2型糖尿病大鼠腎組織氧化應(yīng)激也有改善作用〔5〕，與本研究的結(jié)論一致，但具體機制尚不清楚，推測可能與緩解炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，EDS對實驗性牙周炎大鼠的癥狀有較好的治療效果，同時對牙齦氧化應(yīng)激、MMP2表達(dá)及炎癥反應(yīng)均有較顯著的改善作用。

4　參考文獻(xiàn)

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〔2015-04-20修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)

〔中圖分類號〕R781.4+2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 15-4194-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.037