陳　琰　趙　瑩　劉桂鋒(吉林大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林　長春　3004)

SLC30A8、CDKN2A/2B 、HHEX 、TCF7L2基因多態(tài)性與中國東北漢族人2型糖尿病的關(guān)聯(lián)

陳琰趙瑩劉桂鋒1
(吉林大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，吉林長春130041)

〔摘要〕目的探討SLC30A8、CDKN2A/2B、HHEX、TCF7L2基因多態(tài)性與中國東北漢族人群2型糖尿病(T2DM)的相關(guān)性。方法應(yīng)用連接酶檢測反應(yīng)(LDR)技術(shù)對中國吉林省長春地區(qū)113例T2DM患者及107例正常對照(NC)者SLC30A8基因rs13266634位點、CDKN2A/2B基因rs10811661位點、HHEX基因rs1111875位點、TCF7L2基因rs7903146位點的SNP進行檢測。結(jié)果SLC30A8(rs13266634) CC、CT基因型的空腹胰島素(FINS)、胰島B細(xì)胞功能(HOMA-B)均低于TT基因型(P＜0．05)，總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)均高于TT基因型(P＜0．05)，CC基因型的空腹血糖(FPG)高于TT基因型(P＜0．05)。三組CC、CT、TT基因型合并心血管并發(fā)癥的構(gòu)成比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。CDKN2A/2B (rs10811661) TT、CT基因型的FINS、HOMA-B均低于CC基因型(P＜0．05)，F(xiàn)PG、糖化血紅蛋白(HbA1c)、TC均高于CC基因型(P＜0．05)，TT基因型的TG高于CC基因型(P＜0．05)。三組CC、CT、TT基因型合并微血管并發(fā)癥的構(gòu)成比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。HHEX(rs1111875) GG、GA基因型的FINS、HOMA-B均低于AA基因型(P＜0．01)，F(xiàn)PG、TC、TG均高于AA基因型，GG基因組的低密度脂蛋白膽固醇(LDL) -C高于AA基因組(P＜0．05)。三組GG、GA、AA基因型合并心血管并發(fā)癥的構(gòu)成比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。結(jié)論SLC30A8基因多態(tài)性位點rs13266634、HHEX基因多態(tài)性位點rs1111875與T2DM心血管并發(fā)癥存在一定的相關(guān)性，CDKN2A/2B基因多態(tài)性位點rs10811661與T2DM微血管并發(fā)癥存在一定的相關(guān)性。

〔關(guān)鍵詞〕2型糖尿病;單核苷酸多態(tài)性

1吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院放射線科

第一作者:陳琰(1982-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事2型糖尿病的防治研究。

2型糖尿病(T2DM)是多基因和環(huán)境因素共同作用的一種復(fù)雜性疾病。SLC30A8、CDKN2A/2B、HHEX、TCF7L2基因是2007年Nature和Science上首批鑒定出的與歐洲白種人T2DM發(fā)病相關(guān)的基因〔1～5〕，但這些變異對于具有不同遺傳背景的中國東北漢族人群T2DM患病率的影響尚不清楚。本研究旨在探討應(yīng)用連接酶檢測反應(yīng)(LDR)技術(shù)SLC30A8基因rs13266634位點、CDKN2A/2B基因rs10811661位點、HHEX基因rs1111875位點、TCF7L2基因rs7903146位點的SNP與中國東北漢族人群T2DM的相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1研究對象T2DM組:按知情同意的原則收集2011年12月至2013年12月在我科確診為T2DM的門診或住院患者113例。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合1999年WHO糖尿病診斷〔空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L〕及分型標(biāo)準(zhǔn);②半年內(nèi)無酮癥及其他應(yīng)激情況;③無肝腎功能不全。對照組:遵循知情同意的原則收集同期在醫(yī)院進行健康體檢的無糖尿病家族史的健康者107例。兩組研究對象均為長春地區(qū)漢族人群，且個體間無血緣關(guān)系。受試者禁食8 h以上，晨起空腹抽取肘靜脈血2 ml，檸檬酸鈉抗凝，用于提取基因組DNA。同時進行人體測量血并留取空腹血標(biāo)本用于檢測代謝指標(biāo)，采用穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)和胰島β細(xì)胞功能(HOMA-B)。

1.2實驗方法

1.2.1血液基因組DNA提取采用北京天根生化科技有限公司(離心柱型)試劑盒提取人基因組DNA。

1.2.2PCR反應(yīng)應(yīng)用生物軟件Oligo6.0設(shè)計PCR引物，見表1。以基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件:總體系15 μl，模板1 μl，10×buffer 1.5 μl，MgCl21.5 μl，dNTP 0.3 μl，引物混合0.15 μl，Taq酶0.3 μl。擴增條件: 94℃3 min，94℃15 s，55℃15 s，72℃30 s，35個循環(huán)，72℃3 min。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢驗。

表1　PCR反應(yīng)引物序列

1.2.3多重LDR反應(yīng)根據(jù)LDR探針設(shè)計原則設(shè)計LDR上下游探針，見表2。LDR反應(yīng)體系: PCR產(chǎn)物3 μl，10×Taq DNA ligase buffer 1 μl，Taq DNA ligase (40 U/μl) 0.125 μl，探針(10p) 0.01 μl/條，加H2O補至10 μl。LDR反應(yīng)條件: 94℃30 s，56℃3 min，進行30個循環(huán)。取1 μl延伸產(chǎn)物，加8 μl上樣loading，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法以Hardy-Weinberg平衡法檢測各組基因頻率的群體代表性。應(yīng)用SPSS17.0軟件進行正態(tài)性檢驗、方差分析和χ2檢驗。

2　結(jié)果

2.1基因分型檢測結(jié)果多重PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳檢驗結(jié)果見圖1。多重LDR結(jié)果見圖2。

表2　LDR反應(yīng)探針序列

圖1　PCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果

圖2　基因分型的多重LDR峰圖

2.2基因型頻率和等位基因頻率分析

2.2.1SLC30A8(rs13266634)兩組中CC、CT、TT基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM組CC、CT、TT基因型頻率分別為38.9％、48.7％、12.4％，對照組分別為33.6％、51.4％、15％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 0.770 3，P = 0.68)。T2DM組C和T等位基因頻率分別為63.3％和36.7％，對照組分別為59.3％和40.7％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR =1.180 2，95％CI=0.803 8～1.733 0，χ2=0.715 5，P=0.39)。

2.2.2CDKN2A/2B(rs10811661)兩組中TT、CT、CC基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM組TT、CT、CC基因型頻率分別為31％、47.8％、21.2％，NC組分別為29.9％、50.5％、19.6％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 0.170 8，P = 0.91)。T2DM組T和C等位基因頻率分別為54.9％和45.1％，對照組分別為55.1％和44.9％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR =1.011 1，95％CI=0.694 4～1.472 3，χ2=0.003 3，P=0.95)。

2.2.3HHEX(rs1111875)兩組中GG、GA、AA基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM組GG、GA、AA基因型頻率分別為9.7％、45.2％、45.1％，對照組GG、GA、AA基因型頻率分別為5.6％、44.9％、49.5％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 1.035 6，P= 0.59)。T2DM組G和A等位基因頻率分別為32.3％和67.7％，對照組G和A等位基因頻率分別為28％和72％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR=0.833 3，95％CI=0.553 6 ～1.254，χ2=0.764 2，P=0.38)。

2.2.4TCF7L2(rs7903146)兩組中TT、CT、CC基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(均P＞0.05)。T2DM組TT、CT、CC基因型頻率分別為0％、6.2％、93.8％，對照組分別為0％、1.9％、98.1％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 2.620 8，P = 0.27)。T2DM組T和C等位基因頻率分別為3.1％和96.9％，對照組分別為1％和99％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(OR= 0.295 1，95％CI= 0.060 6～1.437 0，χ2=2.566 1，P=0.11)。

2.3糖尿病組不同基因型人體測量學(xué)及代謝指標(biāo)的比較

2.3.1SLC30A8(rs13266634) CC、CT基因型的FINS、HOMA-B均低于TT基因型(P＜0.05)，TC、TG均高于TT基因型(P＜0.05)，CC基因型的FPG高于TT基因型(P＜0.05)。CC、 CT、TT基因型合并心血管并發(fā)癥的構(gòu)成比分別為61.4％(27/ 17)、45.5％(25/30)、21.4％(3/11)，三組基因型間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

2.3.2CDKN2A/2B(rs10811661) TT、CT基因型的FINS、HOMA-B均低于CC基因型(P＜0.05)，F(xiàn)PG、HbA1c、TC均高于CC基因型(P＜0.05)，TT基因型的TG高于CC基因型(P＜0.05)。CC、CT、TT基因型合并微血管并發(fā)癥的構(gòu)成比分別為29.9％(7/17)、44.4％(24/30)、62.9％(22/13)，三組基因型間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

2.3.3HHEX(rs1111875) GG、GA基因型的FINS、HOMA-B均低于AA基因型(P＜0.01)，F(xiàn)PG、TC、TG均高于AA基因型，GG基因組的LDL-C高于AA基因組(P＜0.05)。GG、GA、AA基因型合并心血管并發(fā)癥的構(gòu)成比分別為72.7％(8/3)、49％ (25/26)、31.4％(16/35)，三組基因型間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

2.3.4TCF7L2(rs7903146)糖尿病組各基因型間的代謝指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，并發(fā)癥的構(gòu)成比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3　T2DM組臨床變量與基因型的關(guān)系(±s)

表3　T2DM組臨床變量與基因型的關(guān)系(±s)

與TT基因型比較: 1) P＜0.05，2) P＜0.01;與CC基因型比較: 3) P＜0.05，4) P＜0.01;與AA基因型比較: 5) P＜0.05，6) P＜0.01; BMI:體重指數(shù); HbA1c:糖化血紅蛋白; TC:總膽固醇; TG:甘油三酯; HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇; LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇; FINS:空腹胰島素

指標(biāo)　SLC30A8(rs13266634)CDKN2A/2B(rs10811661) CC　CT　TT　TT　CT　CC年齡(歲)　51.48±12.13　 51.71±12.22　 57.14±7.7　 52.83±10.8　 51.02±11.1　 54.38±12.3 BMI(kg/m2)　25.48±3.24　 25.35±3.46　 26.87±2.38　 24.77±2.54　 26.02±3.81　 25.77±2.74 FPG(mmol/L)　9.91±2.711)　9.16±2.14　 8.12±1.23　 9.66±2.993)　9.61±2.183)　8.15±0.99 HbA1c(％)　8.70±1.77　 8.39±1.45　 7.85±1.75　 8.65±1.73　 8.62±1.61　 7.73±1.36 TC(mmol/L)　5.59±1.482)　5.44±1.071)　4.49±0.92　 5.49±1.234)　5.66±1.313)　4.59±0.87 TG(mmol/L)　2.83±1.481)　2.56±1.272)　1.52±0.30　 2.91±1.624)　2.59±1.273)　1.86±0.60 HDL-C(mmol/L)　1.13±0.31　 1.20±0.34　 1.09±0.35　 1.18±0.32　 1.13±0.33　 1.19±0.36 LDL-C(mmol/L)　3.24±0.98　 3.32±0.94　 3.28±0.89　 3.35±1.04　 3.36±0.91　 3.02±0.86 FINS(mU/L)　1.47±0.401)　1.48±0.241)　1.69±0.26　 1.48±0.344)　1.46±0.293)　1.65±0.32 HOMA-IR　1.10±0.34　 1.08±0.23　 1.24±0.28　 1.09±0.29　 1.08±0.26　 1.20±0.32 HOMA-B　2.01±0.531)　2.06±0.341)　2.34±0.28　 2.04±0.494)　2.01±0.43)　2.29±0.33指標(biāo)　HHEX(rs1111875)TCF7L2(rs7903146) GG　GA　AA　CT　CC年齡(歲)　47.7±6.53　52.21±11.7　53.27±11.5　55.29±11.2　52.09±11.3 BMI(kg/m2)　25.9±2.85　25.31±3.54　25.79±3.09　25.47±2.67　25.59±3.32 FPG(mmol/L)　10.59±2.826)　10.23±2.545)　8.13±1.31　8.10±1.38　9.40±2.38 HbA1c(％)　9.26±2.12　8.53±1.48　8.18±1.63　8.50±1.70　8.43±1.63 TC(mmol/L)　6.60±0.905)　5.68±1.355)　4.84±0.93　4.96±0.74　5.41±1.29 TG(mmol/L)　3.01±0.995)　2.92±1.326)　2.04±1.25　2.56±0.84　2.53±1.36 HDL-C(mmol/L)　1.26±0.31　1.15±0.33　1.15±0.34　1.03±0.29　1.17±0.33 LDL-C(mmol/L)　4.7±0.245)　3.16±0.83　3.14±0.92　2.88±0.64　3.31±0.96 FINS(mU/L)　1.33±0.16)　1.42±0.316)　1.62±0.32　1.56±0.46　1.50±0.31 HOMA-IR　0.99±0.1　1.07±0.25　1.18±0.33　1.11±0.45　1.11±0.28 HOMA-B　1.81±0.226)　1.93±0.456)　2.28±0.34　2.22±0.52　2.07±0.42

3　討論

2007年，Nature報道了首個在法國人群的T2DM GWAS，發(fā)現(xiàn)SLC30A8、HHEX、EXT2和LOC387761與T2DM的發(fā)病風(fēng)險關(guān)聯(lián)，同時驗證了TCF7L2與T2DM的相關(guān)性。隨后冰島人群研究成功驗證了SLC30A8基因的rs13266634，同時發(fā)現(xiàn)了CDKAL1rs7756992，這兩個位點在高加索人和中國香港人中均得到驗證。同一時期，來自3個研究組DGI、WTCCC /UKT2D和FUSION的GWAS發(fā)表于同一期Science上，均成功驗證了TCF7L2、KCNJ11、PPARγ、SLC30A8和HHEX區(qū)域，還發(fā)現(xiàn)了CDKAL1、IGF2BP2和CDKN2A/B〔1～5〕。Wu等〔6〕研究得出CDKAL1，CDKN2A/B，IGF2BP2，SLC30A8基因變異與T2DM發(fā)病關(guān)，HHEX變異與上海漢族人T2DM發(fā)病相關(guān)，與北京漢族人發(fā)病無關(guān)，HHEX基因在北方人群的結(jié)果與本研究結(jié)果一致。中國香港〔7〕、臺灣〔8〕漢族人研究顯示，TCF7L2基因的rs7903146C/T多態(tài)性與T2DM無相關(guān)性。中國上海地區(qū)漢族人的研究結(jié)果提示SLC30A8 (rs13266634)、CDKN2A/2B (rs10811661)、HHEX(rs1111875)、TCF7L2(rs7903146)基因多態(tài)性與T2DM發(fā)病相關(guān)〔9〕，與本研究結(jié)果不一致。這可能由于本研究樣本量較少導(dǎo)致抽樣偏差以及地區(qū)種族的差異所致。

SCL30A8基因位于8號染色體(8q24)，編碼一種在胰腺β細(xì)胞分泌囊泡中表達的鋅轉(zhuǎn)運體8。通過把鋅轉(zhuǎn)移至有胰島素的囊泡中，來調(diào)節(jié)胰島素的生物合成、穩(wěn)定、儲存〔10〕。結(jié)合文獻SLC30A8(rs13266634)存在T→C的變異。本研究結(jié)果提示rs13266634的C等位基因可能與空腹胰島素分泌不足，胰島功能衰竭相關(guān)。Ingelsson等〔11〕也證實SCL30A8基因變異可增加空腹胰島素原水平，其機制可能通過減少胰島β細(xì)胞增殖或增加其凋亡來減少β細(xì)胞質(zhì)量，從而使胰島素原轉(zhuǎn)化成胰島素的分子過程受到損傷。本研究提示C等位基因可能增加心血管并發(fā)癥的發(fā)病率。Sattar〔12〕在研究糖尿病與心血管疾病的關(guān)系中指出在校正了年齡、性別及其他脂質(zhì)變量的模型中，TC和LDL-C水平增高對心血管疾病的預(yù)測價值更高。本研究C等位基因增加心血管并發(fā)癥發(fā)病率的可能與CC、CT基因型的TC高于TT基因型有關(guān)。CDKN2A/2B基因位于9號染色體(9q21)，是一個已知的腫瘤抑制基因，其產(chǎn)物P16抑制細(xì)胞周期素依賴性激酶4(CDK4)，而CDK4是一個有效的胰腺β細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)劑，CDKN2A/2B基因過表達可導(dǎo)致胰腺發(fā)育不全和糖尿病。本研究提示T等位基因與胰島β細(xì)胞功能受損，胰島素分泌減少相關(guān)，與Wu等〔6〕的研究結(jié)果一致。另外TT基因型增加微血管并發(fā)癥的發(fā)病率，而這是否與FPG、HbA1c高于CC基因型說明長期血糖控制不佳有關(guān)還需進一步深入的研究?；蚴歉闻K和胰腺發(fā)育的必須基因，是WNT信號通路作用的靶點。本研究提示G等位基因可能與T2DM心血管發(fā)病率相關(guān)。與Chen等〔13〕研究結(jié)果一致。同時，本研究還說明HHEX(rs1111875) G等位基因的TC和LDL-C增高可能是增加心血管風(fēng)險的原因。

綜上所述，SLC30A8 (rs13266634 )、CDKN2A/2B (rs10811661)、HHEX(rs1111875)、TCF7L2(rs7903146)未發(fā)現(xiàn)與中國東北漢族人群T2DM相關(guān)，不排除樣本量較少以及種族地區(qū)差異造成的。SLC30A8基因多態(tài)性位點rs13266634、HHEX基因多態(tài)性位點rs1111875與T2DM心血管并發(fā)癥存在一定的相關(guān)性，CDKN2A/2B基因多態(tài)性位點rs10811661與T2DM微血管并發(fā)癥存在一定的相關(guān)性，還有待于進一步研究證實。

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〔2015-03-15修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

·心腦血管及代謝性疾病·

通訊作者:劉桂鋒(1980-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事疾病影像學(xué)診斷研究。

〔中圖分類號〕R589.1

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 15-4201-04;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.15.040