徐冬冬，王韻，楊慧凌，范慶煒，杜冰

(川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000)

1 案例資料

1.1 簡(jiǎn)要案情

1例需鑒定父子關(guān)系的個(gè)人委托案例，委托人陳某(男性，36歲)為了申報(bào)戶口要求確定與孩子陳某某(女性，6歲)父子親緣關(guān)系。

1.2 檢驗(yàn)過程與結(jié)果

1.2.1 初次檢驗(yàn) 采用Chelex-100法提取血樣DNA，分別使用PowerPlex?Fusion(美國(guó)Promega公司)和AGCU EX21+1(江蘇無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司)試劑盒進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，采用ABI 3500遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳和基因分析。兩個(gè)STR試劑盒所檢驗(yàn)的39個(gè)STR位點(diǎn)中除Penta E基因座外，其余基因組符合孟德爾遺傳規(guī)律。在Penta E基因座，Bin內(nèi)被控父與孩子均只有一個(gè)等位基因，分別為“11”和“18”；Bin外約477bp處各有一個(gè)檢出峰，將其手動(dòng)命名為off-ladder峰(以下簡(jiǎn)稱OL峰)。相同實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行1次重復(fù)檢驗(yàn)，分型結(jié)果不變。按照人類DNA熒光標(biāo)記STR分型結(jié)果的分析及應(yīng)用(GA/T 1163-2014)和法醫(yī)學(xué)STR基因座命名規(guī)范(SF/Z JD0105011-2018)中OL等位基因的分析方法，將該OL等位基因命名為等位基因“28”。見圖1。

1.2.2 交互驗(yàn)證 分別采用AGCU EX22(江蘇無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司)和Microreader 21 ID System(北京閱微基因技術(shù)有限公司)試劑盒檢測(cè)兩人血樣。分析顯示，與上述2個(gè)檢測(cè)試劑盒共同的STR基因座(PentaE 除外)分型一致。在Penta E基因座，被控父基因型為“11，28”，孩子的基因型為“18，28”。見圖2。

1.2.3 測(cè)序驗(yàn)證 參照STRBase(https://strbase.nist.gov)中Penta E引物序列(正向引物為：5′-ATTACCAACATGAAAGGGTACCAATA-3′，反向引物為：5′-TGGGTTATTAATTGAGAAAACTCCTTACAATTT-3′)合成引物進(jìn)行單基因擴(kuò)增檢測(cè)，將目的條帶純化后進(jìn)行一代測(cè)序。Penta E基因座的核心基序?yàn)閇AAAGA]，OL的核心序列是[AAAGA]28，根據(jù)國(guó)際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)推薦的STR命名方法，將該等位基因命名為“28”。

1.2.4 父權(quán)指數(shù)計(jì)算及鑒定意見 按照《親權(quán)鑒定技術(shù)規(guī)范》(GB/T37223-2018)，采用中國(guó)漢族群體遺傳學(xué)資料[1]，計(jì)算4個(gè)STR試劑盒所包含的39個(gè)常染色體基因座的累積親權(quán)指數(shù)(combined paternity index，CPI)為4.8317×1015，支持認(rèn)定父子關(guān)系。

2 討論

在親子鑒定中，當(dāng)出現(xiàn)被控父(和或母)與孩子在某個(gè)STR基因座的分型結(jié)果不符合遺傳規(guī)律時(shí)，除考慮該基因座發(fā)生突變外，還應(yīng)注意是否存在等位基因漏檢的可能[2]。研究表明，90%以上的STR突變?yōu)橐徊酵蛔?，多步突變發(fā)生的機(jī)會(huì)較小[3]。因此，本案Penta E基因座被檢父等位基因“11”發(fā)生7步突變?yōu)椤?8”的可能性很低。進(jìn)一步分析分型圖譜發(fā)現(xiàn)，被檢父和孩子在Bin外相同位置存在檢出峰，推測(cè)該基因座存在等位基因漏檢的可能。采用AGCU EX22和Microreader 21 ID System試劑盒進(jìn)行核驗(yàn)，證實(shí)PowerPlex?Fusion試劑盒在Penta E基因座的分型漏檢了被檢父和孩子的等位基因“28”。 Penta E等位基因“28”是罕見的等位基因，澳大利亞Grover首次在STRbase中對(duì)該稀有等位基因進(jìn)行了報(bào)道[4]，國(guó)內(nèi)已報(bào)道的其在漢族群體基因頻率為0.000 2[1]。

研究表明，OL等位基因的形成原因有4種[5]：(1)重復(fù)單位完整重復(fù)，但重復(fù)次數(shù)在等位基因分型參照物范圍外，如本例中的Penta E等位基因“28”，比分型標(biāo)準(zhǔn)物最大等位基因“24”多4個(gè)重復(fù)單位；(2)重復(fù)單位不完整重復(fù)，如TH01基因座等位基因“9.3”；(3)側(cè)翼序列堿基的插入或缺失，如D7S820等位基因9.1，是由側(cè)翼序列插入1個(gè)C堿基導(dǎo)致；(4)較大片段的缺失，如D21S11等位基因21.1，是核心序列區(qū)29 bp的缺失導(dǎo)致。對(duì)于檢案工作中遇到的可疑OL等位基因，首先應(yīng)通過重復(fù)擴(kuò)增或更換其它STR試劑盒進(jìn)行核驗(yàn)，以排除污染或非特異性擴(kuò)增等影響[6]。其次，根據(jù)檢出峰特征綜合分析，對(duì)于出現(xiàn)在基因座兩個(gè)相鄰等位基因之間的OL等位基因，一般屬于等位基因的微變異，不易出現(xiàn)分型誤判；對(duì)于超出基因座Allelic Ladder之外的OL等位基因，其分型確定較為復(fù)雜。此類OL等位基因?qū)儆诖笃位蛐∑蔚任换颍赡苈淙胂噜徎蜃?，易引起誤判[7]。由于PCR-CE檢測(cè)到的OL等位基因只反映出其長(zhǎng)度大小，不能確定具體形成原因。因此，建議對(duì)檢案中遇到的OL等位基因進(jìn)行序列測(cè)定，以便使分型結(jié)果更加嚴(yán)謹(jǐn)、準(zhǔn)確。OL等位基因在人群中的基因頻率一般較低，有些屬于稀有等位基因(頻率<0.1%)[8]。低頻率的OL等位基因的發(fā)現(xiàn)和確證，可顯著提高個(gè)體識(shí)別能力和排除概率，有助于檢案和研究[9-10]。