馮曉娟，鄭倩，馮亞嵐，黃榮，楊健，袁磊

(川北醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院，1.機能學實驗教學中心，2.病原生物學教研室，四川 南充 637000)

乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是一種經(jīng)蚊蟲叮咬傳播的人獸共患病，可導致人中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重損傷[1]。JEV主要流行于亞洲地區(qū)，全球每年報告67 900例臨床病例，其中約75%發(fā)生于0～14歲的兒童，病死亡率20%～30%，約有50%的治愈者會留下持續(xù)性后遺癥[2]。目前尚無特異性療法，只能對癥治療。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA分子介導的使靶mRNA發(fā)生特異性降解，以阻斷翻譯，即轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，在高等生物基因表達調(diào)控和抵御病原體過程中發(fā)揮重要作用[3]。目前人工合成的siRNA可以直接轉(zhuǎn)染到細胞中介導RNAi，但時效較短。使用含有短發(fā)夾RNA (shRNA)表達盒的質(zhì)?；虿《据d體在細胞中生成siRNA，可以顯著提高RNAi的效率和持續(xù)性。慢病毒對多種細胞有較強親和力與低毒性，是目前較為理想的RNAi傳導工具[4]。RNAi分子治療有可能成為一種新的抗病毒策略。多項研究[5-7]表明，運用RNAi可以有效抑制蜱傳腦炎病毒、登革熱病毒和丙型肝炎病毒等黃病毒在細胞和小鼠體內(nèi)的增殖。本研究以同為黃病毒屬的JEV為對象，選取4個病毒基因作為靶點，使用慢病毒載體分別在BHK21細胞和小鼠體內(nèi)介導RNAi，研究其抗病毒效果，為探索RNAi用于抗病毒治療的可能性及潛在靶點提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

幼倉鼠腎細胞(BHK21)購自美國ATCC保藏中心，由川北醫(yī)學院病原中心實驗室培養(yǎng)，采用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃ 5% CO2條件下傳代培養(yǎng)。JEV毒株SCYA201201(基因組序列，GenBank登錄號為KU508409)由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院提供，于川北醫(yī)學院病原中心實驗室保存，熒光定量PCR預混液購至寶生物工程有限公司?？笿EV E蛋白鼠源單克隆抗體，熒光素Alexa Fluor 488標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體購至Abcam生物技術(shù)有限公司。清潔級昆明雌鼠與昆明乳鼠由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 siRNA序列設(shè)計與重組慢病毒的構(gòu)建 通過對國內(nèi)外23株具代表性的JEV毒株，進行全基因組序列比對，選定JEV的C、NS3、NS4A與NS5基因為靶點。運用線設(shè)計軟件DSIR(http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html)，設(shè)計出4條shRNA序列并合成。見表1。將shRNA序列與載體pGLVU6/RFP連接構(gòu)建重組載體，并將重組載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入人腎上皮細胞(293T)包裝出攜帶shRNA序列的重組慢病毒，滴度>108TU/mL，此步驟由上海吉瑪基因科技有限公司完成。陰性對照慢病毒LV-NC購自上海吉瑪基因。

表1 靶基因與shRNA序列

1.2.2 慢病毒感染 待BHK21細胞在6孔板中鋪滿70%，用PBS洗滌兩次后，將重組慢病毒按感染復數(shù)MOI=10接種細胞，每孔加入2 mL含10% FBS和5 μg/mL polybrene的DMEM培養(yǎng)液。置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h后，用熒光顯微鏡觀察紅色熒光。

1.2.3 抑制JEV感染細胞 分別在感染重組慢病毒48 h、96 h后，按照感染復數(shù)MOI=0.1接種乙腦病毒SCYA201201株。病毒吸附1.5 h后，棄上清，每孔加入2 mL DMEM維持液(含2% FBS)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)72 h后，收毒做熒光定量RT-PCR與病毒滴度檢測。另設(shè)實驗組，接種JEV 48 h后，做間接免疫熒光檢測。設(shè)陰性慢病毒LV-NC對照組、無慢病毒JEV攻毒組(Non-RNAi)與空白對照組(Mock)。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 待接種JEV 72 h后，收集細胞與上清，反復凍融3次，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用25 μL熒光定量PCR體系：2 μL cDNA模板、12.5 μL SYBR? Premix Ex TaqTMII、8.5 μL ddH2O、上游和下游引物各1 μL。定量PCR結(jié)果采用相對定量計算方法：以JEV E基因作為目標基因，BHK21細胞的GAPDH基因作為內(nèi)參基因，運用2-△△Ct法計算JEV RNA的相對含量。見表2。

表2 實時熒光定量PCR引物序列

1.2.5 病毒滴度檢測 待接種JEV 72 h后，反復凍融3次后，離心收集上清，作10倍梯度稀釋后，加入鋪滿BHK21細胞的6孔板中，500 μL/孔。病毒吸附1.5 h后,棄上清，每孔加入2 mL含1%甲基纖維素的DMEM維持液(含2% FBS)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)5 d。去上清，用含2%甲醛的結(jié)晶紫染液染色15 min后，做蝕斑計數(shù)，計算病毒滴度。

1.2.6 間接免疫熒光檢測 待接種JEV 48 h后，用PBS洗滌3次，依次進行固定、通透及封閉。加入500倍稀釋的JEV E蛋白鼠源單克隆抗體，4 ℃孵育12 h。棄一抗，洗滌3次后，加入1 000倍稀釋的熒光二抗，避光室溫孵育45 min。避光洗滌3次后，用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光。

1.2.7 抑制JEV感染小鼠 (1)抑制乳鼠腦內(nèi)的JEV增殖：將7 d齡乳鼠分為7組，每組5只。分別在攻毒前3 d和1 d，顱內(nèi)注射2.5×105TU重組慢病毒。按5×LD50的劑量攻毒，顱內(nèi)注射JEV SCYA201201株(LD50=1.02 log10 PFU)，5 d后處死，取腦組織制成10%組織懸液,反復凍融3次，離心收集上清，用0.22 μM濾膜過濾后，測定病毒滴度。(2)攻毒保護試驗：將3周齡雌性昆明鼠分為7組，每組10只。分別在攻毒前3 d和1 d，顱內(nèi)注射5×105TU重組慢病毒。按50×LD50的劑量攻毒，顱內(nèi)注射JEV SCYA201201株(LD50=1.87 log10 PFU)，連續(xù)觀察21 d，記錄發(fā)病與死亡情況。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒的構(gòu)建與感染效率

感染重組慢病毒48～96 h后，6孔板中絕大多數(shù)細胞均呈現(xiàn)紅色熒光，且各組間熒光強度與數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。慢病毒感染組與空白對照組的細胞形態(tài)和增殖數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明各重組慢病毒均能高效感染BHK21細胞，且對細胞無明顯毒性。見圖1。

2.2 對細胞中JEV增殖的抑制效果

熒光定量PCR結(jié)果顯示，在48 h組中，相較于LV-NC(JEV RNA載量相對值=1)，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5分別使細胞中的JEV RNA載量降低89.7%、87.7%、74.6%和72.4%。96 h組與48 h相比，對JEV的抑制效果略有降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，證明重組慢病毒LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5均能顯著抑制JEV在BHK21細胞中的增殖，且具有一定持續(xù)性，其中LV-C和LV-NS3的抑制效果強于LV-NS4A和LV-NS5(P<0.05)。病毒蝕斑實驗顯示，在48 h組中，相較于LV-NC對照組(107.51PFU/mL)，LV-C(104.43PFU/mL)、LV-NS3(104.79PFU/mL)、LV-NS4A(105.42PFU/mL)和LV-NS5(105.33PFU/mL)均使細胞中的病毒滴度降低(P<0.05)。其中LV-C與LV-NS3使病毒滴度分別降低了約1 200倍與525倍，96 h組的降低程度與48 h組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)，證明重組慢病毒能顯著且持續(xù)抑制JEV在BHK21細胞中的增殖。間接免疫熒光檢測顯示，在熒光顯微鏡下，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A和LV-NS5組的綠色熒光數(shù)量少于LV-NC對照組(P<0.05)，空白對照組無熒光出現(xiàn)，證明重組慢病毒顯著抑制了細胞中的JEV增殖。見圖2-圖4。

2.3 對乳鼠腦內(nèi)JEV增殖的抑制效果

乳鼠腦組織懸液中的病毒滴度檢測顯示，相較于LV-NC對照組(108.21PFU/mL)，LV-C(104.96PFU/mL)、LV-NS3(105.29PFU/mL)、LV-NS4A(105.82PFU/mL)和LV-NS5(105.68PFU/mL)均使乳鼠腦內(nèi)的病毒滴度降低(P<0.05)。其中LV-C使病毒滴度降低了約1 700倍，證明重組慢病毒能顯著抑制JEV在乳鼠腦內(nèi)的增殖。見圖5。

2.4 攻毒保護實驗

3周齡小鼠攻毒保護實驗顯示，LV-C、LV-NS3、LV-NS4A與LV-NS5組的存活率分別為70%、50%、60%、50%。LV-NC對照組全部死亡，空白對照組全部存活，證明重組慢病毒對3周齡小鼠具有較好保護作用。見圖6。

3 討論

JEV的基因組為單股正鏈RNA，其基因組即是復制模板，也行使mRNA功能。因此RNAi能同時抑制JEV基因組的復制和病毒蛋白的合成，具有機制上的優(yōu)勢。C基因具有較高的保守性，編碼的C蛋白主要參與病毒的包裝與核衣殼的形成[8]。NS3蛋白是具有絲氨酸蛋白酶和RNA解旋酶活性的多功能蛋白，參與病毒蛋白的剪切與RNA復制。JEV復制時，細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上會形成病毒RNA復制復合體，NS3蛋白和病毒RNA聚合酶NS5蛋白，作為復合體的核心組分，在JEV復制周期中起關(guān)鍵作用[9]。NS4A蛋白是NS3發(fā)揮蛋白酶活性的輔助因子，其還能通過誘導細胞自噬來促進病毒增殖[10-11]。

有研究[12-13]表明，靶向JEV的C、E和NS5基因的RNAi可有效抑制病毒感染細胞和小鼠，其中靶向E基因的RNAi表現(xiàn)出最強的抗病毒效果。為了探索新的抗病毒RNAi靶點及更系統(tǒng)地評估RNAi對JEV的抑制作用，本次選取C、NS3、NS4A與NS5基因，設(shè)計新的RNAi位點進行研究，結(jié)果顯示，4個RNAi組均能明顯抑制JEV對細胞和小鼠的感染(P<0.05)。其中LV-C組表現(xiàn)出最佳的抗病毒效果，使細胞中的病毒滴度降低約1 200倍，對3周齡小鼠的保護率達到70%。本研究分別在慢病毒感染細胞48 h和96 h后進行JEV接毒，結(jié)果顯示96 h組與48 h組相比，抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，仍保持高抗病毒活性。與之前采用質(zhì)粒載體的研究相比[14]，其抗病毒的持續(xù)性有明顯提升。本次動物實驗，慢病毒沒有出現(xiàn)致毒性，但觀察期僅為21 d，因此要對安全性做出準確判斷，還需更長期系統(tǒng)的研究。目前脫靶效應(yīng)是RNAi技術(shù)面臨的一個主要問題。為降低脫靶效應(yīng)，可針對靶基因采用多位點聯(lián)合沉默的方式來降低脫靶率[15]。因此本研究認為針對JEV多基因位點的聯(lián)合RNAi可能會具有更佳的抗病毒效果，這有待進一步探索。

綜上所述，以JEV的C、NS3、NS4A與NS5基因為靶點，由慢病毒介導的RNAi對病毒感染細胞和小鼠有顯著抑制作用，其中靶向C基因的RNAi的抗病毒效果最強，其可能成為一種感染前的預防性治療手段。由于本研究均在JEV感染前進行RNAi，因此其感染后的抗病毒效果還有待進一步研究。