李運(yùn)麗，宋誠(chéng)誠(chéng)，郝世誠(chéng)，張金佩，劉 巖，徐 妍，袁 麗，3

（1.中國(guó)政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088；2.司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100088；3.上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∕∕司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（司法鑒定科學(xué)研究院），上海 200063）

Y 染色體上的短串聯(lián)重復(fù)片段（short tandem repeat，STR）是父系遺傳關(guān)系鑒定和強(qiáng)奸案混合斑中男性個(gè)體識(shí)別的有效手段，是常染色體遺傳標(biāo)記的重要補(bǔ)充［1-2］。隨著男性家系檢測(cè)的增多和YSTR數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的Y-STR試劑由于低突變率常常不能有效區(qū)分不同男性家系［3］。快速變異的Y-STR（rapidly mutating Y-STR，突變率≥1.00×10-2）［4-5］有助于縮小偵查范圍、鎖定犯罪嫌疑人，是法醫(yī)DNA 領(lǐng)域新的研究、檢測(cè)方向。然而，在歐美白人中被定義為快速變異的Y-STR 基因座有的在中國(guó)人群中突變率并不高，并且個(gè)別基因座融入復(fù)合擴(kuò)增難度大［6］。為了提升Y-STR 鑒別男性家系的能力，本研究篩查了既往研究報(bào)告中在我國(guó)群體突變率高的21個(gè)Y-STR基因座，建立五色熒光復(fù)合擴(kuò)增體系，并對(duì)北方漢族群體進(jìn)行調(diào)查，為高突變的Y-STR在父子間突變情況提供基礎(chǔ)性資料。

1 材料和方法

1.1 樣本

北方漢族健康男性無(wú)關(guān)個(gè)體志愿者500 人，每人及其兒子組成父子對(duì)500 對(duì)，經(jīng)知情同意采集外周血，保存在FTA 卡上，父子關(guān)系均經(jīng)“母-子-父”或“父-子”親子鑒定，親權(quán)指數(shù)均超過(guò)10 000。

1.2 方法

1.2.1 基因座的篩選 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以往研究結(jié)果［6］，從國(guó)外13個(gè)RMY-STR中選取在中國(guó)群體中突變率高的DYF399S1、DYF404S1、DYS449、DYS518、DYS526b、DYS547、DYS570、DYS576、DYS612、DYS626 和DYS627 11 個(gè)基因座，另外，根據(jù)文獻(xiàn)篩選在中國(guó)民族群體突變率≥4.0×10-3具有高變異的9個(gè)Y-STR基因座［7-10］，包 括DYS390、DYS439、DYS456、DYS458、DYS460、DYS481、DYS549、DYS552 和DYS630 基因座。另外，本體系也納入了常用的DYS391 基因座，其在中國(guó)南方漢族人群［7］突變率為3.3×10-3。除了DYS481和DYS612系三核苷酸重復(fù)序列外，其他均為四核苷酸重復(fù)序列（表1）。

表1 篩選的Y-STR基因座及其基本信息Table 1 Selected Y-STR loci and their basic information

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 在GeneBank 中查詢所選取的高變異Y-STR 基因座的基因序列信息，利用Primer 3 軟件（http：∕∕bioinfo.ut.ee∕primer3∕）設(shè)計(jì)引物，并利用UCSC（http：∕∕genome.ucsc.edu∕）中的BLAT軟件檢驗(yàn)引物的特異性。根據(jù)各基因座核心序列情況設(shè)計(jì)其在體系中的位置，每對(duì)引物的前導(dǎo)鏈5'端分別標(biāo)記6-FAM、HEX、TAMRA、ROX 熒光染料，內(nèi)標(biāo)選用橙色的ILS550，委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成引物。

1.2.3 復(fù)合擴(kuò)增體系的建立與引物優(yōu)化 PCR 體系中使用2×MasterMix（北京金馬晟和科技有限公司）緩沖液，內(nèi)含Taq酶。在離心管中配置10 μL直擴(kuò)體系，包含：2×MasterMix 4 μL，引物1～5 μL，用去離子水補(bǔ)足至10 μL。用0.5 mm 的打孔器對(duì)打孔1 片加入各個(gè)離心管中。PCR 熱循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：95 ℃11 min、94 ℃10 s、59 ℃1 min、72 ℃30 s，27 個(gè)循環(huán)，60 ℃60 min，4 ℃保持，在9700 擴(kuò)增儀（AB公司）上進(jìn)行PCR反應(yīng)。在PCR擴(kuò)增體系中分別設(shè)置各個(gè)基因座的引物濃度，進(jìn)行引物濃度優(yōu)化，使基因座之間的等位基因峰值達(dá)到平衡。

1.2.4 擴(kuò)增片段的分離與檢測(cè) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用ABI 3130 型基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物1 μL、ILS 500 內(nèi)標(biāo)0.15 μL、Hi-DiTM‐Formamide 10 μL 混勻，加入自動(dòng)進(jìn)樣盤(pán)，編制進(jìn)樣表，采用GM 模式電泳。電壓15 000 V、進(jìn)樣 時(shí)間10 s，電泳30 min。電泳數(shù)據(jù)應(yīng)用GeneMapper?IDX 1.4軟件分析，讀取等位基因的片段大小。

1.2.5 北方漢族群體及家系突變情況調(diào)查 采用本研究建立的21個(gè)Y-STR 基因座的五色熒光復(fù)合擴(kuò)增體系，對(duì)500 對(duì)中國(guó)北方漢族父子樣本進(jìn)行檢測(cè)。直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)突變個(gè)數(shù)，用突變個(gè)數(shù)除以父子對(duì)數(shù)獲得突變率，并利用二項(xiàng)概率分布計(jì)算95%的置信區(qū)間［11］。在500 名無(wú)關(guān)男性樣本群體中，用算式（Gene Diversity，GD）=n（1-ΣPi2）／（n-1）；Pi表示等位基因頻率，n代表樣本數(shù)。計(jì)算各基因座的基因多態(tài)性，觀察每個(gè)樣本是否存在相同的Y-STR單倍型。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

本文成功設(shè)計(jì)了21對(duì)引物，建立了1個(gè)五色熒光復(fù)合擴(kuò)增體系。在10 μL 直接擴(kuò)增PCR 反應(yīng)體系中，各基因座引物濃度優(yōu)化結(jié)果為：2.5 μmol∕L各基因座引物在0.18～0.50 μL 之間。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，21個(gè)Y-STR 基因座均得到有效擴(kuò)增（圖1），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在90～370 bp之間，電泳圖譜顯示擴(kuò)增效果好，各基因座之間及多拷貝等位基因之間的峰高基本平衡。除DYS612 為三核苷酸重復(fù)、stutter 峰略高外，其他基因座stutter 峰低于主峰的10%。根據(jù)DYS526a∕b 序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物僅擴(kuò)增DYS526b基因座（圖2）。

圖1 21個(gè)Y-STR基因座復(fù)合擴(kuò)增優(yōu)化圖譜Fig.1 A genotyping of a sample with 21 Y-STR Optimized amplification system

2.2 基因多態(tài)性結(jié)果

在500 個(gè)北方漢族無(wú)關(guān)個(gè)體中，本次建立的21個(gè)Y-STR 檢測(cè)體系，未發(fā)現(xiàn)有相同的單倍型?；蚨鄳B(tài)性結(jié)果請(qǐng)見(jiàn)表2。在一些多拷貝Y-STR 基因座上發(fā)現(xiàn)異常分型，見(jiàn)圖3-5。

2.3 父子突變率調(diào)查結(jié)果

500 個(gè)父子對(duì)中觀察到16 對(duì)出現(xiàn)2 個(gè)基因座的突變，1對(duì)出現(xiàn)3個(gè)基因座的突變，未發(fā)現(xiàn)有超過(guò)3 個(gè)基因座同時(shí)出現(xiàn)突變的情況。其他具體突變的情況見(jiàn)表2。

表2 21個(gè)Y-STR基因座在中國(guó)北方漢族群體的基因多樣性和突變率Table 2 Gene diversity and mutation rates of 21 Y-STRs in Han population of Northern China

3 討論

Ballantyne 等［12］通過(guò)系列研究表明13 個(gè)RM Y-STR 組合（DYS570、DYS576、DYS518、DYS526a∕b、DYS626、DYS627、DYS449、DYS547、DYS612、DYF387S1、DYF399S1、DYF403S1 a∕b 和DYF404S1）無(wú)論在多態(tài)性還是個(gè)體識(shí)別能力方面均明顯強(qiáng)于當(dāng)前常用的17 個(gè)Y-STR 的Yfiler 系統(tǒng)（美國(guó)AB 公司）。我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)：①DYF387S1、DYF403S1b、DYS526a 在中國(guó)漢族群體突變率沒(méi)有到達(dá)快速變異基因座的標(biāo)準(zhǔn)；②DYF403S1a∕b 基因座單一引物擴(kuò)增效率高、沒(méi)有雜峰，但只要與其它基因座復(fù)合擴(kuò)增，產(chǎn)生很多非特異性產(chǎn)物，難以納入20 多個(gè)基因座的復(fù)合檢測(cè)體系中；③Ballantyne 等［12］公布的DYS526a∕b引物，其中一條引物能與DNA 模板的兩段序列結(jié)合（DYS526a引物與模板有兩個(gè)堿基的錯(cuò)配），產(chǎn)生兩個(gè)最少相差180 bp的等位基因，由于錯(cuò)配和大片段擴(kuò)增缺乏優(yōu)勢(shì)的原因，DYS526a和DYS526b擴(kuò)增效率都不高。鑒于DYS526b 基因座序列包含了DYS526a基因座，在本次體系構(gòu)建中我們?cè)O(shè)計(jì)引物僅能檢測(cè)DYS526b 基因座（圖2），可提高其在復(fù)合擴(kuò)增體系中擴(kuò)增效率。本次納入復(fù)合擴(kuò)增體系的基因座既要優(yōu)選在中國(guó)群體突變率高的，又要考慮復(fù)合擴(kuò)增效率和減少非特異性峰的影響，最終建立的21 個(gè)Y-STR 五色熒光復(fù)合擴(kuò)增體系，每個(gè)基因座均獲得了準(zhǔn)確分型，復(fù)合體系擴(kuò)增DNA 分型結(jié)果穩(wěn)定、均衡，具有種屬特異性。

圖2 DYS526a/b 基因座序列Fig.2 DYS526a/b Locus sequence

法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的Y-STR 基因座一般為單拷貝，但有少部分Y-STR 基因座為多拷貝。其原因是因?yàn)樵赮 染色體重復(fù)回文區(qū)域有重復(fù)拷貝存在［13］或一對(duì)引物能與不同序列結(jié)合［14］產(chǎn)生多個(gè)等位基因。本體系中DYF404S1 為二拷貝基因座，DYF399S1為三拷貝基因座，相對(duì)于單拷貝Y-STR 基因座，多拷貝Y-STR 基因座具有較高的遺傳多態(tài)性，存在多個(gè)等位基因，有助于法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別和親緣關(guān)系鑒定。然而，DYF404S1 和DYF399S1 會(huì)出現(xiàn)異常分型，在500 個(gè)無(wú)關(guān)男性樣本的DNA 分型圖譜中，DYF404S1 基因座上出現(xiàn)三等位基因14 例（圖3），DYF399S1基因座出現(xiàn)四等位基因10例（圖4）和五等位基因2 例（圖5），且有5 個(gè)樣本在這兩個(gè)基因座上同時(shí)出現(xiàn)稀有拷貝數(shù)等位基因分型。出現(xiàn)異常多等位基因DNA 分型提示在混合斑鑒定的案件中，對(duì)于嫌疑人數(shù)目的確定會(huì)存在困難，需結(jié)合其他檢驗(yàn)結(jié)果綜合分析。

圖3 DYF404S1上出現(xiàn)三等位基因分型Fig.3 Distinctive tri-allelic pattern in DYF404S1

圖4 DYSF399S1上出現(xiàn)四等位基因分型Fig.4 Distinctive tetra-allelic pattern in DYSF399S1

圖5 DYSF399S1上出現(xiàn)五等位基因分型Fig.5 Distinctive five-allelic pattern in DYSF399S1

快速變異的Y-STR 基因座核心序列結(jié)構(gòu)復(fù)雜、重復(fù)次數(shù)多，需要更多的空間來(lái)容納這些基因座，故而本文建立了五色熒光復(fù)合擴(kuò)增體系，使用了6-FAM、HEX、TAMRA、ROX 和ILS550 熒光染料組合。根據(jù)在北方漢族人群中的調(diào)查結(jié)果，顯示21 個(gè)Y-STR 基因座的基因多態(tài)性除DYS391 為0.402 3外，其余20個(gè)Y-STR 在0.611 8以上，在500個(gè)無(wú)關(guān)男性個(gè)體中，未觀察到有相同單倍型的情況出現(xiàn)。在500 個(gè)父子對(duì)中大部分基因座的突變率遠(yuǎn)高于常染色體STR 及目前法醫(yī)學(xué)常用的Y-STR基因座，突變率最高達(dá)到7.4×10-2，發(fā)生在DYF399S1 基因座上。觀察500 對(duì)北方漢族父子的21 個(gè)Y-STR 基因座DNA 分型圖譜，共出現(xiàn)134 次等位基因突變，其中一步突變出現(xiàn)127 次，兩步突變出現(xiàn)7 次，符合逐步突變機(jī)制。增加突變與減少突變數(shù)目相同，均為67 次。本次研究突變率≥1.00×10-2的12個(gè)Y-STR基因座中有10個(gè)基因座屬于復(fù)合或復(fù)雜核心序列，核心序列重復(fù)次數(shù)較多，體現(xiàn)了基因座的突變率受重復(fù)序列結(jié)構(gòu)和等位基因重復(fù)次數(shù)的影響，重復(fù)序列結(jié)構(gòu)復(fù)雜度越高、平均重復(fù)次數(shù)越多的基因座，突變率相對(duì)更高［15-16］。Ballantyne 等［4］提出重復(fù)區(qū)毗鄰的不可變序列長(zhǎng)度對(duì)基因座的突變率有一定影響，不可變序列越長(zhǎng)則會(huì)增加DNA 合成時(shí)復(fù)制滑脫的機(jī)會(huì)，本次研究中重復(fù)區(qū)毗鄰的不可變序列長(zhǎng)度大于30 bp的基因座有9 個(gè)（DYF404S1、DYS439、DYS449、DYS518、DYS526b、DYS547、DYS552、DYS626 和DYS627），其中突變率≥6.00×10-3有8 個(gè)，驗(yàn)證了上述理論。DYS630 和DYS390 基因座雖不在Ballantyne 等列出的RM Y-STR 之中，但在北方漢族群體中突變率達(dá)到快速變異標(biāo)準(zhǔn)。本研究在DYS391、DYS456基因座上未發(fā)生突變，而在南方漢族群體［7］中的突變率為3.3×10-3和4.4×10-3。另外，DYS549、DYS481、DYS552、DYS460 突變率接近Y-STR 的平均突變率，為2.0×10-3，分析可能是由于本次調(diào)查父子對(duì)樣本量的限制，同時(shí)也體現(xiàn)了Y-STR 突變率受不同地域、人群的差異的影響［17］。

應(yīng)用這些高變異Y-STR 基因座進(jìn)行法醫(yī)學(xué)親子鑒定及個(gè)人識(shí)別，更易于區(qū)分具有父系親緣關(guān)系的男性個(gè)體，有助于解決目前法醫(yī)學(xué)應(yīng)用Y-STR基因座只能排除不能認(rèn)定的瓶頸。但需要注意的是，由于高變異Y-STR 突變率較高，在親子鑒定中對(duì)有父系親緣關(guān)系的男性個(gè)體容易錯(cuò)誤排除，故并不能完全取代現(xiàn)有Y-STR 試劑盒，但可以作為CO‐DIS 常染色體和常規(guī)低突變Y-STR 系統(tǒng)基因座的補(bǔ)充，具有良好的法醫(yī)應(yīng)用價(jià)值。