劉丹平，池沛冬，梅美華，游 瑩，黃俊琪

（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院器官移植科∕∕廣東省器官捐獻(xiàn)與移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∕∕廣東省器官移植國際科技合作基地，廣東廣州 510080；2.中山大學(xué)腫瘤防治中心檢驗(yàn)科，廣東廣州 510060）

Zeste 增強(qiáng)子同源物1（enhancer Zeste of homo‐log 1，EZH1）和Zeste增強(qiáng)子同源物2（enhancer Zeste of homolog 2，EZH2）是多梳蛋白抑制復(fù)合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的兩個(gè)功能亞基，可以催化組蛋白3賴氨酸27位點(diǎn)（H3K27）甲基化至其三甲基化形式（H3K27me3），誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄阻斷和基因沉默；EZH1 還可通過與參與RNA 聚合酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄起始和∕或延伸的因子的賴氨酸殘基甲基化促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活［1-2］。UNC1999是一個(gè)EZH1∕2雙重抑制劑，通過與S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adeno‐syl-L-methionine，SAM）競爭發(fā)揮作用，可口服生物利用，細(xì)胞毒性低［3-4］，已被報(bào)道能抑制套細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌等多種腫瘤［5-7］，為多種癌癥治療帶來了新的希望。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)UNC1999具有潛在的抑制病毒復(fù)制的作用［8］。本研究利用多色流式細(xì)胞術(shù)對(duì)用藥后外周血免疫細(xì)胞亞群表型進(jìn)行分析，為UNC1999的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2020年12月至2021年1月中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院成年健康體檢者，簽署知情同意書后，使用其檢測剩余血液標(biāo)本，研究方案已通過中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理審查批件號(hào)：［2018］259）。實(shí)驗(yàn)使用12 份健康者血液樣本（2 mL∕份），為減少個(gè)體差異帶來的誤差，每4 份血液樣本提取PBMC 后混合均勻，獲得PBMC 細(xì)胞數(shù)為（1.57±0.27）×107個(gè)，其中1∕4 細(xì)胞用于CCK8 試驗(yàn)，3∕4 細(xì)胞經(jīng)處理后用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。實(shí)驗(yàn)所用的1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液、青鏈霉素、胎牛血清均為Gibco 產(chǎn)品；CCK-8 試劑盒購自日本同仁；Ficoll 分離液（17-1440-03）；流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter）；DuraClone IM 表型檢測管（B53309、B53318、B53328、B53351、B53340、B53346；Beck‐manCoulter）、固定液（8 546859；Beckman Coul‐ter）、PerFix-nc Kit（B31168；Beckman Coulter）。

1.2 方法

1.2.1 外周血PBMC 提取及細(xì)胞培養(yǎng) 外周血（EDTA 抗凝）500×g離心5 min 后，棄血漿，加入兩倍血液體積的PBS，混勻后，在15 mL 離心管加入Ficoll 分離液（Ficoll 分離液：血液：PBS=1：1：2），管子傾斜45 ℃，緩慢加入混了PBS 的血，形成明顯分層，2 300 r∕min 離心20 min（離心機(jī)半徑r=9.5 cm），升速為6，降速為0，離心完畢后中間白色層細(xì)胞為PBMC，分離出PBMC后用PBS洗滌細(xì)胞3次。使用含體積分?jǐn)?shù)10 g∕L 胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素的1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)PBMC（培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2）。

1.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞懸液以100 000 個(gè)∕孔的密度鋪于96 孔板，每孔100 μL，二氧化碳孵育箱培養(yǎng)（37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2）。分別加入終濃度梯度為0、5、10、20 和40 μmol∕L 的UNC1999（溶劑為DMSO），作用12 h 后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃孵育4 h，于450 nm 下檢測OD 值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=［（實(shí)驗(yàn)孔-空白孔）∕（對(duì)照孔-空白孔）］×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞亞群 以1×106∕mL 將細(xì)胞接種于12 孔板中，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)12 h 加入藥物，使終濃度為10 μmol∕L，對(duì)照組加入DMSO，終濃度為2 μL∕mL，作用36 h后終止，離心去培養(yǎng)基，加PBS洗滌1次，留下100 μL（包含1×106細(xì)胞），混勻后，各加100 μL 樣本至貝克曼干粉管，Treg 管加50 μL 樣本；常溫孵育15 min（避光），各加2 mL PBS，離心后吸凈上清，各加400 μL PBS 重懸（Treg 管除外），上機(jī)檢測；Treg 管盡量吸干凈上清，加入5 μL 固定液，混勻，避光放置10 min；加入300 μL 的破膜液，室溫避光孵育1 h，加入2 mL 的PBS，離心5 min 去上清，加入500 mL PBS重懸，上機(jī)檢測（表1）。

表1 UNC1999組與對(duì)照組外周血免疫細(xì)胞表型的比較Table 1 Comparison of immunophenotype of peripheral immune cells in UNC1999 and DMSO groups（）

表1 UNC1999組與對(duì)照組外周血免疫細(xì)胞表型的比較Table 1 Comparison of immunophenotype of peripheral immune cells in UNC1999 and DMSO groups（）

續(xù)表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位間距）描述。配對(duì)數(shù)據(jù)兩組間比較，差值數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊，采用配對(duì)t檢驗(yàn)；否則采用校正t檢驗(yàn)或配對(duì)資料的符號(hào)秩和檢驗(yàn)。多組均數(shù)比較，各組定量資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性采用單因素方差進(jìn)行分析，反之用Kruskal WallisH檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)再進(jìn)行兩兩比較。均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UNC1999的細(xì)胞存活率檢測

不同濃度的UNC1999 與PBMC 作用12 h 后，CCK-8 法檢測細(xì)胞OD 值計(jì)算其存活率。經(jīng)檢驗(yàn)5組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=134.953，P＜0.001），5、10 μmol∕L 濃度與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.992，0.087），且細(xì)胞的存活率保持在80%以上，遂選擇UNC1999 10 μmol∕L 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理?xiàng)l件（圖1）。

圖1 UNC1999作用后PBMC的存活率Fig.1 The cell viability of PBMC after UNC1999 treatment

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

2.2.1 用藥組與對(duì)照組單核細(xì)胞亞群的比較 相比對(duì)照組，用藥組單核細(xì)胞占PBMC 比例差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），經(jīng)典型單核細(xì)胞（CD14++CD1 6-）比例上調(diào)，中間型單核細(xì)胞（CD14++CD16+）和非經(jīng)典型單核細(xì)胞（CD14+CD16+）比例下調(diào)（P＜0.05；圖2）。

圖2 用藥組與對(duì)照組單核細(xì)胞亞群的比較Fig.2 Comparison of monocyte subsets in UNC1999 and DMSO groups

2.2.2 用藥組與對(duì)照組NK亞群的比較 相比對(duì)照組，用藥組NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CD56dimCD16+，CD56domCD16+細(xì)胞亞群比例明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖3）。

圖3 用藥組與對(duì)照組NK細(xì)胞亞群的比較Fig.3 Comparison of NK subsets in UNC1999 and DMSO groups

2.2.3 用藥組與對(duì)照組B 細(xì)胞的比較 相比對(duì)照組，UNC1999組B細(xì)胞比例差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），初始B 細(xì)胞（na?ve B）比例明顯上調(diào)，記憶B細(xì)胞（non switched memory B cells，class switched memory B cells，memory B Cells）、過渡B 細(xì)胞（tran‐sitional B cell）、漿細(xì)胞（plasmablasts）比例下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖4）。

圖4 用藥組與對(duì)照組B細(xì)胞亞群的比較Fig.4 Comparison of B cells subsets in UNC1999 and DMSO groups

2.2.4 用藥組與對(duì)照組樹突狀細(xì)胞亞群的比較相比對(duì)照組，UNC1999 組DC 比例上調(diào)，其中pDC∕DC 下調(diào)，mDC∕DC 上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖5）。

圖5 用藥組與對(duì)照組DC細(xì)胞亞群的比較Fig.5 Comparison of DC subsets in UNC1999 and DMSO groups

2.2.5 用藥組與對(duì)照組T 淋巴細(xì)胞亞群的比較相比對(duì)照組，UNC1999 組CD8+T 細(xì)胞亞群中CD8+中樞記憶T 細(xì)胞（central memory T cell，TCM）、CD8+PD-1+比例上調(diào)，CD8+效應(yīng)記憶T 細(xì)胞（effec‐tive memory T cell，TEM）比例下調(diào)；CD4+T細(xì)胞亞群中CD4+CD27+比例下調(diào)（P＜0.05），其余淋巴細(xì)胞亞群在兩組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖6）。

圖6 用藥組與對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群的比較Fig.6 Comparison of T lymphocyte subsets in UNC1999 and DMSO group

3 討論

UNC1999處理后CD16表達(dá)下調(diào)，CD16是Ⅲ型免疫球蛋白Fc 受體，分為FcγRⅢA 和FcγRⅢB，F(xiàn)cγRIIIB 僅中性粒細(xì)胞表達(dá)，F(xiàn)cγRⅢA 與FcRγ 鏈結(jié)合，根據(jù)免疫受體酪氨酸激活基序（immunore‐ceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）或免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif，ITIM）介導(dǎo)細(xì)胞激活和抑制，起雙向調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，ITAM還存在抑制性ITAM（in‐hibitory ITAM，ITAMi）構(gòu)型，可阻斷炎癥引起的鈣內(nèi)流、ROS 產(chǎn)生、內(nèi)吞作用、白細(xì)胞浸潤等作用，這使得FcγRⅢA具有靶向治療炎癥性疾病的潛力［9-10］。

外周單核細(xì)胞根據(jù)CD14 和CD16 分為經(jīng)典型單核細(xì)胞（CD14++CD16-），中間型單核細(xì)胞（CD14++CD16+）以及非經(jīng)典型單核細(xì)胞（CD14+CD1 6+）。儲(chǔ)備在髓外部位的經(jīng)典型單核細(xì)胞可聚集到感染組織中，在控制感染、限制炎癥損傷方面起重要作用；非典型單核細(xì)胞被招募到非炎癥組織中，負(fù)責(zé)清除細(xì)胞碎片和修復(fù)內(nèi)皮［11］。在敗血癥、艾滋病毒、炎癥性腸病以及代謝性疾病及心血管疾病中，中間和∕或非經(jīng)典型單核細(xì)胞亞群的細(xì)胞數(shù)或比例增加，CD16+單核細(xì)胞可產(chǎn)生大量TNF-a 和IL-1b 導(dǎo)致促炎環(huán)境［12］，并維持炎癥因子的高水平狀態(tài)，被稱為“促炎癥亞群CD16+單核細(xì)胞”。研究［13］顯示，CD16+單核細(xì)胞在SARS-CoV-2 感染患者中與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，可能與該細(xì)胞群在CO‐VID-19 患者肺部富集及其在維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面的功能等相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)用藥后經(jīng)典型單核細(xì)胞比例明顯上調(diào)，CD16+單核細(xì)胞群比例下調(diào)，提示UNC1999 可能抑制CD16 表達(dá)，可能有利于減緩細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)。

NK 細(xì)胞通過多個(gè)方面發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制過度的免疫應(yīng)答以避免病理損傷，一些腫瘤也可利用這些生理調(diào)節(jié)功能導(dǎo)致免疫耐受和腫瘤逃逸［14］。NK 細(xì)胞分成CD56bri和CD56dimNK 細(xì)胞群，CD56briNK 細(xì)胞代表相對(duì)年輕的、不成熟的NK 細(xì)胞，在成熟的過程中獲得表達(dá)CD16 的能力，成為CD56dimNK 細(xì)胞，CD16 受體可介導(dǎo)直接細(xì)胞毒作用和抗體依賴性細(xì)胞毒作用［15］。在體外，PBMC 分離出來的CD56briNK 細(xì)胞與滑膜成纖維細(xì)胞接觸后上調(diào)CD16，分化為CD56dimNK 細(xì)胞，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，具有更強(qiáng)的細(xì)胞溶解能力［16］。淋巴結(jié)和扁桃體中的CD56briNK 細(xì)胞能夠在IL-2 刺激下上調(diào)CD16分化為CD56dimNK細(xì)胞［17］。有研究［18］表明EZH1∕2抑制劑促進(jìn)CD56+前體細(xì)胞增殖，使前體細(xì)胞譜系向3 型固有淋巴樣細(xì)胞傾斜，揭示了參與NK細(xì)胞成熟調(diào)節(jié)的表觀遺傳機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)用藥組CD56dimCD16+，CD56domCD16+細(xì)胞亞群比例下調(diào)，但該藥物改變NK細(xì)胞表型的作用機(jī)制及對(duì)感染免疫的影響仍需進(jìn)一步的深入研究。

B 細(xì)胞中的EZH2 失活將B 細(xì)胞阻斷在增殖和不成熟階段，構(gòu)成淋巴瘤發(fā)展的關(guān)鍵因素［19-20］。套細(xì)胞淋巴瘤中EZH1 表達(dá)下調(diào)，EZH2∕EZH1 比值的失衡可能在淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制中起作用［21］。相比對(duì)照組，用藥后初始B細(xì)胞比例上調(diào)，記憶B細(xì)胞、過渡B細(xì)胞、漿細(xì)胞比例下調(diào)，藥物可能阻滯了B細(xì)胞的分化，其中EZH1或者EZH1∕EZH2比值的失衡是否也影響了外周B細(xì)胞的分化，值得深入探討。

樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）分為漿細(xì)胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC）和髓樣DC（myeloid∕con‐ventional DC，mDC）。pDC 通過感知病毒感染快速產(chǎn)生大量干擾素和細(xì)胞因子，可減緩病毒復(fù)制并導(dǎo)致炎癥環(huán)境；mDC 可限制病毒復(fù)制，促進(jìn)T 細(xì)胞免疫［22-23］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示用藥組DC 總比例以及mDC∕DC 上調(diào)，UNC1999 可能促進(jìn)DC 的表達(dá)，有利于發(fā)揮抗原提呈作用。

T 細(xì)胞根據(jù)CD45RA 和CCR7 分成初始T 細(xì)胞（CD45RA+CCR7+na?ve，TN），中樞記憶T細(xì)胞（CD45RA-CCR7+Central memory，TCM），效應(yīng)記憶T細(xì)胞（CD45RA-CCR7-effector memory，TEM），終末效應(yīng)記憶T 細(xì)胞（CD45RA+CCR7-effector memory re-expressing CD45RA，TEMRA）。CD8+TN，CD8+TCM具有自我更新能力，在慢性感染中，TCM 可被重新激活以清除或抑制病原體［24］。程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）是活化T 細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)因子，是T 細(xì)胞耗竭的標(biāo)志［25-27］。CD27屬于腫瘤壞死因子受體超家族，其在癌癥細(xì)胞的表達(dá)使其成為抗癌選擇之一，抗CD27 單克隆抗體的激動(dòng)劑與阻斷PD-1配體的協(xié)同作用可增強(qiáng)衰竭的CD8+T 細(xì)胞的增殖和功能［28］。本研究顯示該藥物影響了T 細(xì)胞的部分亞群比例，但其對(duì)T 細(xì)胞功能的影響需進(jìn)一步探索。

UNC1999是具有潛力的抗腫瘤藥物，研究發(fā)現(xiàn)該藥物可能具有抗病毒作用［8］，因此研究UNC1999對(duì)免疫系統(tǒng)影響十分必要。我們的結(jié)果顯示UNC1999 改變了PBMC 的細(xì)胞表型，在合并其他病原體感染的情況下，使用UNC1999 導(dǎo)致上述細(xì)胞表型的改變可能影響正常的免疫功能，導(dǎo)致免疫應(yīng)答的低效或延遲反應(yīng)。