李 俊,楊涵滟,韓 慧,李 梅,王冠蕾
(1.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室和心腦血管研究中心,廣東廣州 510080;2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院特診醫(yī)療病區(qū),廣東廣州 510630)
血小板的主要生理功能是止血,當血管內(nèi)發(fā)生出血事件或者動脈粥樣硬化斑塊破裂時,血小板活化分泌致密顆粒促進血小板自身活化、單核細胞-血小板以及中性粒細胞-血小板聚集,纖維蛋白原暴露,血小板膜上糖蛋白Ⅵ(glycoprotein Ⅵ)與纖維蛋白結(jié)合從而引發(fā)血栓形成[1]。血小板的異常激活是血栓相關(guān)疾病如心肌梗塞的主要病理機制。二磷酸腺苷(ADP)受體P2Y12介導(dǎo)的血小板活化信號通路是血小板活化的核心機制,如目前臨床上應(yīng)用最廣泛的抗血小板藥物之一就是P2Y12受體抑制劑。P2Y12是一種G 蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-cou‐pled receptors GPCRs),ADP 與其細胞外部分結(jié)合能激活P2Y12[2-6]。除了與ADP結(jié)合外,P2Y12激活還能促進整合素αⅡbβ3 活化,進一步放大凝血酶、血栓素A2 介導(dǎo)的血小板活化信號。P2Y12激活后通過PI3K-AKT 信號通路促進血小板聚集,促進血小板介導(dǎo)血栓的形成;同時這條信號通路還能促進致密顆粒釋放多種血小板活性物質(zhì),對血小板介導(dǎo)的血栓形成發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。囊性纖維化跨膜電導(dǎo) 調(diào) 節(jié) 子(cystic fibrosis transmembrane conduc‐tance regulator,CFTR)在1989 年首次由Riordan 克隆[7],CFTR基因編碼一種cAMP 激活的氯離子通道。CFTR單基因突變可引起一種人類遺傳疾病囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)。其中最常見的基因突變是CFTR外顯子上3 個堿基對的缺失,可引起CFTR 蛋白第508 位置上的苯丙氨酸殘基缺失(ΔF508)[8]。CF 病人由于CFTR 編碼的氯離子通道功能障礙,引起呼吸道及腸道黏膜等腺上皮器官分泌異常,黏膜增厚及黏液粘稠,導(dǎo)致呼吸困難、反復(fù)感染等癥狀[9-10]。以往研究提示CF 病人外周血小板活性增高[10],最近有報道應(yīng)用巨核細胞∕血小板特異性敲除CFTR小鼠證實了CFTR敲除可促進血小板介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[11],促進血小板和淋巴細胞相互作用。但是,CFTR 和血小板活化的相關(guān)性及具體分子機制仍未完全清楚。由于P2Y12激活在血小板活化過程中起關(guān)鍵作用,本研究還揭示了CFTR可能通過調(diào)控P2Y12蛋白表達從而影響血小板活化。
本研究所涉及的所有動物實驗經(jīng)中山大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準,批準編號為:SYSU-IA‐CUC-2020-000446,并且符合國家科技部《實驗動物護理和使用指南》。CFTR基因敲除小鼠[CFTRtm1UncTg(FABPCFTR)1Jaw∕J;Cftr-∕-]購于美國The Jackson Laboratory,該小鼠是C57BL∕6、FVB∕N和129的混合遺傳背景。文中所涉及的C57BL∕6小鼠全部購置于中山大學(xué)實驗動物中心,動物許可證編號為SCXK(粵)2018-0003。P2Y12全基因敲除(P2Y12
-∕-)小鼠購于美國Shering Plough 公司,該小鼠的遺傳背景為C57BL∕6。本研究中所有小鼠均為8~16 周齡,性別體質(zhì)量匹配。所有小鼠飼養(yǎng)于中山大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)條件為:SPF 級動物房,每籠5 只小鼠,每日清掃,專人喂養(yǎng)。室溫(25±2)℃,相對濕度(60±10)%,模擬正常晝夜生物節(jié)律。
人巨核細胞株(Megakaryocyte cell strains;Meg-01)細胞購自美國American type culture collec‐tion(ATCC),RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司,CFTR抗體購于美國Novus公司,P2Y12抗體購于英國Abcam 公司,PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 抗體購于美國Cell Signaling Technolo‐gy 公司,β-actin 抗體和α-tublin 抗體購于中國Boster 生 物 公 司,CFTRinh-172(CFTR inhibitor)、ADP、膠原蛋白、腎上腺素購于美國Sigma 公司,BCA 試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific 公司,ECL試劑盒購于美國Millipore公司。
多功能酶標儀:美國Bio Tek 公司;高速冷凍離心機:德國Eppendorf Centrifuge 公司;電轉(zhuǎn)裝置:美國Bio-Rad 公司;凝膠成像系統(tǒng):美國ChemiDoc XRS 公司;石蠟切片機:美國Thermo Fisher Scientif‐ic公司。
1.4.1 小鼠外周血血小板提取 分別取8~16 周的Cftr-∕-鼠和C57BL∕6(Cftr+∕+)鼠,用10 g∕L 戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠。打開小鼠腹腔,棉簽分離出小鼠腹主動脈,使用2 mL 注射器進行腹主動脈取血,全血轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中。在25℃,300×g條件下離心2 min,得到上層富含血小板血清。將上層血清在25 ℃,500×g條件下再次離心5 min,棄去上清得到血小板沉淀,留下備用。
1.4.2 肺栓塞模型構(gòu)建和HE 染色 分別取8~16周Cftr-∕-鼠和Cftr+∕+鼠兩組(n=6)。用0.8 mg∕kg 膠原蛋白和60 μg∕kg 腎上腺素注射入下腔股靜脈,30 min 后仍存活小鼠為肺栓塞模型建模成功。處死后取出肺組織,PBS 沖洗后置于40 g∕L 多聚甲醛中固定過夜。從固定液中取出肺組織,用0.1 mol∕L PBS 溶液洗3次,然后將肺組織依次放入5%、10%、15%的蔗糖梯度溶液中脫水30 min,最后將其放入20%的蔗糖溶液中4 ℃脫水過夜。將組織取出用濾紙吸干后,用OTC 包埋劑包埋,制備肺臟組織冰凍切片,切片做Hematoxylin-eosin(H&E)染色,顯微鏡下觀察血栓水平。
1.4.3 ADP刺激Meg-01細胞實驗 用含有100 mL∕L FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)Meg-01 細胞,待細胞密度至5×105∕mL 時,分別孵育不同濃度的ADP(0、0.3、1、5和10 μmol∕L),孵育后提取細胞蛋白。
1.4.4 免疫印跡法 將細胞或者提取的血小板加入RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑(cocktail)冰上裂解20 min。在4 ℃,15 000×g條件下離心15 min,得到蛋白上清液。用BCA 試劑盒蛋白定量后,按每孔30 μg 蛋白上樣。用Bio-Rad 儀器進行SDSPAGE 電泳2 h,轉(zhuǎn)膜。室溫封閉90 min 后,與相應(yīng)一抗抗體4 ℃孵育過夜,TBST 洗膜后,用二抗室溫孵育90 min,ECL 反應(yīng)顯色,在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-rad)下顯影。使用Image J 1.42 軟件,根據(jù)條帶灰度值,對目的蛋白表達進行相對定量分析[12]。
數(shù)據(jù)數(shù)值均采用均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)處理兩樣本間比較采用Student’st檢驗。多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),多組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義后,對于不同濃度處理組檢測結(jié)果和對照組比較采用Dunnett’st檢驗;所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism version 8.20 軟件統(tǒng)計。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
以膠原蛋白(0.8 mg∕kg)∕腎上腺素(60 μg∕kg)注射入Cftr-/-和同周齡Cftr+/+的小鼠下腔股靜脈,以誘導(dǎo)小鼠肺動脈血栓形成。注射30 min 后處死小鼠,取肺組織切片行HE染色。如圖1所示,Cftr-/-小鼠的肺動脈血栓栓塞數(shù)量明顯大于Cftr+/+小鼠(n=6)。
圖1 CFTR 基因敲除增加肺動脈血栓血栓栓塞數(shù)目Fig.1 CFTR knockout increased thrombus formation in the pulmonary artery thrombosis model
分離8 周齡Cftr-/-及Cftr+/+小鼠外周循環(huán)血液的血小板,Cftr-/-小鼠血小板P2Y12蛋白表達顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01;圖2A);Cftr-/-小鼠血小板PI3K 和AKT 蛋白磷酸化水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01;圖2B);與Cftr+/+組相比,Cftr-/-小鼠血小板PI3K 和AKT 總蛋白水平無顯著差異。
如圖3 所示,P2Y12-/-小鼠外周血小板上CFTR蛋白表達與WT 小鼠相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
圖3 P2Y12基因敲除不影響小鼠外周血小板CFTR蛋白表達Fig.3 P2Y12 KO has no influence on CFTR protein expression in mouse circulating platelets
如圖4 所示,用不同濃度ADP(0、0.3、1、5 和10 μmol∕L)刺激人巨核細胞株Meg-01 細胞,顯示P2Y12蛋白表達逐漸增加,5 μmol∕L ADP 刺激時,P2Y12蛋白表達即顯著增加(5 μmol∕L:1.2±0.3vs.0 μmol∕L:0.4±0.1,q=4.684,P=0.003 4),具有統(tǒng)計學(xué)意義。CFTR 蛋白表達則隨著ADP 刺激濃度增加而逐漸下降(F=22.51,P<0.000 1),與對照組相比,1 μmol∕L ADP 刺激時CFTR 表達即顯著下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義(1 μmol∕L:0.7±0.1vs.0 μmol∕L:1.1±0.1,q=6.214,P=0.000 4)。ADP刺激活化P2Y12后,其下游PI3K 以及AKT 蛋白磷酸化表達也顯著增強,而總蛋白并沒有改變。另外,ADP 在1~10 μmol∕L 濃度范圍與MEG-01 細胞共孵育12 h 未觀察到其對于細胞增殖有影響(結(jié)果未顯示)。
圖4 ADP刺激Meg-01細胞對CFTR和P2Y12蛋白表達的影響Fig.4 The effects of ADP on the protein expression of CFTR and P2Y12 in Meg-01 cells
如圖5 所示,不同濃度的CFTRihn-172(0、1.25、2.5、5 和10 μmol∕L)與Meg-01 細胞共孵育24 h,發(fā)現(xiàn)CFTRinh-172 不影響CFTR 蛋白表達,而P2Y12蛋白表達則隨著CFTRinh-172 刺激濃度增加而逐漸升高(方差分析統(tǒng)計量F=12.59,P<0.000 1),與未加CFTRinh-172 組相比,5 μmol∕L 的CFTRinh-172 引起P2Y12蛋白表達顯著增加(5 μmol∕L:0.9±0.3vs.0 μmol∕L:0.4±0.1,q=4.7,P=0.000 5)。
圖5 CFTRinh-172誘導(dǎo)Meg-01細胞P2Y12蛋白表達升高Fig.5 CFTRinh-172 induced an increase of P2Y12 protein expression in Meg-01 cells
本文主要發(fā)現(xiàn)了阻斷CFTR 氯通道或是降低CFTR 蛋白表達均能夠通過誘導(dǎo)循環(huán)血液血小板P2Y12表達的升高,從而影響血小板活化。同時,應(yīng)用Cftr-/-小鼠肺栓塞顯著加重,提示CFTR 可能參與病理情況下由血小板活化所引起的后續(xù)事件如血栓和炎癥等。
血小板活化無論是在動脈和靜脈血栓形成過程中,均占據(jù)核心地位[1]。早期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CF病人的血小板高反應(yīng)活性,包括血小板-淋巴細胞微顆粒增加[10,13-14];感染綠膿桿菌的CF患者血小板產(chǎn)生的炎癥因子sCD40L 顯著增加[15-16]。這些研究提示CFTR 氯通道功能降低促進血小板活化。但CFTR調(diào)控血小板活化的機制并不清楚。我們應(yīng)用特異性通道組阻斷劑CFTRinh-172 以阻斷Meg-01細胞上的跨膜Cl-外流,模擬了CFTR 氯通道功能降低,發(fā)現(xiàn)CFTRinh-172 可濃度依賴性誘導(dǎo)P2Y12表達。同時,我們發(fā)現(xiàn)在Cftr-/-小鼠靜息情況下血小板上的P2Y12蛋白表達和PI3K-AKT 磷酸化水平都顯著升高,PI3K-AKT磷酸化是P2Y12下游經(jīng)典的血小板聚集信號分子[17-18],上述發(fā)現(xiàn)提示CFTR基因敲除不但通過上調(diào)P2Y12促進血小板活化,也可能影響血小板活化的后續(xù)事件,如血栓形成、血管炎癥等。但值得注意的是,由于CFTR氯通道基因在多種組織和細胞上廣泛分布,CFTR 是否能調(diào)控血小板聚集和血栓形成應(yīng)該在血小板特異性敲除CFTR小鼠上進行驗證。
ADP 是體內(nèi)最重要的引起血小板聚集的物質(zhì)[17,20-21],我們采用體外ADP 刺激Meg-01 細胞以模擬在體的血小板活化狀態(tài),由于血小板是由骨髓巨核細胞或者肺的巨核細胞分化產(chǎn)生的無核血細胞。血小板在體內(nèi)存活時間約7~14 d,在體外無法培養(yǎng)。人成巨核細胞白血?。∕eg-01)細胞已公認為一種研究血小板電生理特性或者長時程功能蛋白或基因表達的替代細胞株,因為:①巨核細胞是最直接的血小板前體,它們在功能性分子表達和特性上有很多的相似之處。②由于巨核細胞較大的尺寸、特殊的形態(tài)以及結(jié)合到巨核細胞∕血小板特異性細胞表面標記物CD41的能力。我們發(fā)現(xiàn)ADP誘導(dǎo)P2Y12及其下游PI3K-AKT 上調(diào)的同時,CFTR蛋白表達顯著下降,這與Cftr-/-小鼠實驗結(jié)果是一致的。另外,P2Y12的激活還能放大其他血小板活性物質(zhì)如凝血酶介導(dǎo)的血小板分泌活動,并通過放大磷脂酰絲氨酸的膜上暴露,血小板衍生的微粒形成和膠原誘導(dǎo)的組織因子(TF)暴露來促進血栓形成、血管炎癥反應(yīng)[5-6]。是否CFTR 可能通過調(diào)控P2Y12,繼而影響血小板其他功能,也需要進一步研究。另外,我們在P2Y12-/-小鼠血小板上發(fā)現(xiàn)CFTR 蛋白表達和WT 鼠相比無明顯變化,這提示CFTR位于P2Y12活化信號通路的上游,但中間通過哪些信號分子介導(dǎo),現(xiàn)在還不清楚。
綜上所述,我們揭示了CFTR 調(diào)控血小板活化的一個新機制:阻斷CFTR 氯通道或是降低CFTR蛋白表達可上調(diào)血小板P2Y12表達從而增強血小板活化,并上調(diào)P2Y12下游血小板聚集信號分子如PI3K-AKT。