周 芹，宋 艷，李金河，梁青春

（1.中山大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510080；2.中山大學附屬第一醫(yī)院病理科，廣東廣州 510080；3.南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510630）

血管鈣化（vascular calcification）是常見的慢性腎臟病血管病變，其發(fā)病機制十分復雜。傳統(tǒng)觀點認為血管鈣化僅僅是鈣磷礦物質被動沉積于血管壁的過程。但是，越來越多的研究報道：在血管鈣化過程中，大量的骨相關蛋白表達上調，改變基因的表達水平可影響血管鈣化的發(fā)展［1-3］，說明血管鈣化是可調控的，治療血管鈣化成為可能。氧化應激是導致慢性腎臟病血管鈣化的關鍵因素［4-5］，抑制氧化應激可成為干預血管鈣化的有效策略。血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）是抑制氧化應激的關鍵酶，目前臨床上尚無誘導HO-1 表達的藥物用來干預血管鈣化。柚皮素（Naringenin，NRG）是一種天然的黃酮類化合物，具有清除自由基和抗氧化的作用［6］。研究報道柚皮素可抑制血管平滑肌細胞增殖和血管內膜增生［7-8］，然而柚皮素對高磷高鈣誘導的血管鈣化是否有效尚不清楚。在本研究中，我們采用血管平滑肌細胞和血管環(huán)鈣化模型，研究NRG 對高磷高鈣誘導的血管鈣化的作用，并闡明HO-1 介導NRG 抑制血管鈣化的機制，為慢性腎臟病血管鈣化的防治提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

細胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清（FBS）、TRIzol、BCA 蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；NRG、茜素紅、β-甘油磷酸、活性氧試劑盒購自Sigma 公司；鈣檢測試劑盒購自北京雷根生物公司；逆轉錄反應試劑盒、SYBR green 試劑盒購自Ta‐KaRa 公司；Western blot 超敏發(fā)光液購自Millipore公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和藥物處理

參考文獻［9-10］的方法，從雄性SD 大鼠（南方醫(yī)科大學動物中心，許可證號：SCXK（粵）2011-0015）的胸主動脈分離血管平滑肌細胞。使用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基處理大鼠血管平滑肌細胞，代細胞長滿后傳代。鈣化培養(yǎng)基（10 mmol∕L 的β-甘油磷酸+3 mmol∕L 的CaCl2）處理血管平滑肌細胞7 d誘導細胞鈣化，普通生長培養(yǎng)基處理的細胞作為陰性對照。為了研究NRG對細胞鈣化的影響，在高磷高鈣的條件下，用不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）處理血管平滑肌細胞7 d。動物的使用已獲中山大學附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會的批準。

1.3 血管環(huán)組織培養(yǎng)和藥物處理

分離主動脈血管環(huán)［11］，使用1%戊巴比妥鈉麻醉處死雄性SD 大鼠，暴露和分離胸主動脈，用眼科剪將其剪成5 mm 左右長的血管環(huán)，加入鈣化培養(yǎng)基，藥物處理組血管環(huán)加入不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）7 d 后，收集血管標本檢測鈣化程度。

1.4 檢測細胞鈣化

參考文獻［11-12］，采用茜素紅染色法檢測血管平滑肌細胞和血管環(huán)鈣化。將培養(yǎng)皿從細胞培養(yǎng)箱中取出，放置室溫下，去除培養(yǎng)基，用PBS溶液洗3 次，加入40 g∕L 的多聚甲醛，固定細胞10 min，然后用去離子水洗培養(yǎng)皿，加入2%茜素紅（pH 4.2）溶液孵育5 min，加入去離子水洗去背景色，倒置顯微鏡下拍攝細胞。加入1 mL 甲酸液體，充分混勻后液體變成黃色，用多功能酶標儀在波長為405 nm處檢測吸光值。

1.5 檢測血管環(huán)鈣化

血管環(huán)茜素紅染色：用40 g∕L 的多聚甲醛固定動脈環(huán)，使用梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟浸泡血管環(huán)，包埋好血管環(huán)制成血管石蠟塊，將其切成5 μm 厚的組織切片，然后脫蠟水化，把切片組織浸泡在2%茜素紅溶液中孵育5 min，去除多余染色液，用中性樹膠封片保存，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 檢測鈣離子濃度

采用比色法檢測鈣離子濃度，參考鈣檢測試劑盒說明書，先用預冷PBS 清洗細胞和血管組織，加入蛋白裂解液處理，然后低溫離心（3 000×g，4 ℃，3 min），將上清樣品轉移至1.5 mL 離心管中，將2.5 μL 的待測樣品和鈣標準品加入96 孔板中，配制鈣離子顯色工作液，每孔各加入200 μL 顯色液，室溫避光靜置孵育10 min，使用多功能酶標儀檢測在610 nm處的吸光值。

1.7 活性氧水平檢測

采用活性氧檢測試劑盒檢測活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，去除培養(yǎng)基，用PBS 溶液洗3 次，洗細胞后加入熒光染料二氫乙啶（dihy‐droethidium，DHE），37 ℃避光孵育30 min，然后用PBS清洗細胞，熒光顯微鏡下拍照。

1.8 熒光定量qPCR

將細胞培養(yǎng)基吸取丟棄，加入1 mL RNA 提取試劑TRIzol，參照試劑公司說明提取血管平滑肌細胞總RNA。取1 μg mRNA，加入Takara PrimeScript RT試劑，將mRNA逆轉錄為cDNA，配制20 μL PCR反應體系：2×SYBR premix（10 μL），50× ROX Ref‐erence Dye Ⅱ（0.4 μL），Primer mix（0.4 μL），cD‐NA（1μL），ddH2O（8.2 μL），將PCR 反應物混勻隨后放入Real Time PCR 儀上，進行熒光定量PCR 反應：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性15 s 和60 ℃退火延伸1 min（40 次循環(huán)）。所用的引物信息如下：βactin（forward）：TGTCACCAACTGGGACGATA，βactin（reverse）：GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA；HO-1（forward）：TTCAGAAGGGTCAGGTGTCC，HO-1（reverse）：CTGTGTGGCTGGTGTGTAAG。采用β-actin為內參基因，2ΔΔCt的方法計算目的基因mRNA的相對量表達水平。

1.9 Western blot

加入蛋白裂解液提取血管平滑肌細胞總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白質的濃度。蛋白樣品100 ℃加熱10 min 后蛋白質充分變性。每孔上樣20 μg蛋白樣品，采用8% SDS-PAGE 膠進行電泳分離蛋白，然后將蛋白電轉移至PVDF 膜，TBST 洗膜3次，加入5%脫脂奶粉封閉液在室溫下孵育1 h。加入一抗HMOX-1 抗體（Proteintech，1：1 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，然后加入二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，加入超敏發(fā)光液ECL 試劑，將膜放入LAS 500發(fā)光成像儀內曝光顯影。

1.10 統(tǒng)計學分析

所有的計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 軟件分析數(shù)據，兩組以上均值比較采用單因素方差分析（One way-ANOVA）檢驗，兩兩比較采用Turkey法。當P＜0.05時被認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 NRG抑制大鼠血管平滑肌細胞鈣化

我們采用含高磷高鈣的鈣化培養(yǎng)基（calcifying medium，CM）誘導大鼠血管平滑肌細胞鈣化。為研究NRG 對高磷高鈣誘導的血管平滑肌細胞鈣化的作用，在CM 的條件下，不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）處理大鼠血管平滑肌細胞7 d。茜紅素染色結果顯示：普通培養(yǎng)基（Growth medium，GM）處理的細胞未見鈣化沉積，CM 組的血管平滑肌細胞鈣化明顯增強（圖1A）；使用不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）后，大鼠血管平滑肌細胞鈣化程度減輕（圖1A），其中以濃度為20 μmol∕L 的NRG效果最為明顯。定量分析茜素紅染色結果顯示（方差分析的F=178.183，P=0.000 3）：與GM 組比較，CM組的細胞鈣化明顯增強（圖1B，P=0.000 02）；與CM 組比較，NRG 處理組的細胞鈣化程度明顯減輕（圖1B，P＜0.001）。另外，不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）都能降低細胞鈣離子濃度（圖1C，P＜0.001），20 μmol∕L 的NRG 效果最好。這些結果說明NRG 可以濃度依賴性地抑制高磷高鈣誘導的血管平滑肌細胞鈣化，且濃度為20 μmol∕L 的NRG 抑制血管鈣化的作用最為明顯。

圖1 NRG對高磷高鈣誘導的大鼠血管平滑肌細胞鈣化的影響Fig.1 Effect of NRG on high phosphate/calcium-induced calcification of rat VSMCs

五組定量分析茜素紅染色結果比較，經單因素方差分析，五組間差異有統(tǒng)計學意義（F=178.183，P=0.000 3）；采用Turkey 法進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)CM 組與GM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 02），NRG（5 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 16），NRG（10 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 37），NRG（20 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 83）。

2.2 NRG抑制大鼠血管環(huán)鈣化

為進一步研究NRG 對血管鈣化的作用，我們采用不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）處理血管環(huán)7 d。染色結果和定量分析顯示（方差分析的F=267.048，P=0.000 04）：與GM 組比較，CM 組的血管環(huán)鈣化程度明顯加重（P＜0.001；圖2A、B）；與CM組比較，NRG 處理組的血管環(huán)鈣化程度明顯減弱（P＜0.001；圖2A、B）。另外，我們發(fā)現(xiàn)：NRG 可顯著降低血管組織鈣離子濃度（P＜0.001；圖2C）。

圖2 NRG對高磷高鈣誘導的大鼠血管環(huán)鈣化的影響Fig.2 Effect of NRG on high phosphate/calcium-induced calcification of rat aortic rings

五組定量分析茜素紅染色結果比較，經單因素方差分析，五組間差異有統(tǒng)計學意義（F=267.048，P=0.000 04）；采用Turkey法進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)CM 組與GM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 37），NRG（5 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 32），NRG（10 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 17），NRG（20 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 44）。

2.3 NRG抑制血管平滑肌細胞氧化應激

由于NRG 具有清除自由基和抗氧化的作用，因此我們研究了NRG 對血管平滑肌細胞氧化應激的影響。結果顯示（方差分析的F=29.89，P=0.000 1）：CM 處理可升高血管平滑肌細胞ROS 水平，而使用NRG 可明顯降低ROS 水平（圖3A、B），說明NRG 可減輕血管平滑肌細胞氧化應激。

圖3 柚皮素對高磷高鈣誘導的大鼠血管平滑肌細胞氧化應激的影響Fig.3 Effect of NRG on high phosphate/calcium-induced oxidative stress in rat VSMCs

四組定量分析茜素紅染色結果比較，經單因素方差分析，四組間差異有統(tǒng)計學意義（F=29.89，P=0.0001）；采用Turkey 法進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)CM 組與GM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.00094），NRG（10 μmol∕L）組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.012），NRG（20 μmol∕L）組與CM組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 5）。

2.4 NRG上調血管平滑肌細胞HO-1的表達水平

HO-1 是抑制氧化應激的關鍵酶，我們研究了NRG 對血管平滑肌細胞HO-1 表達水平的影響。qPCR 結果顯示（F=248.488，P=0.000 02）NRG（20 μmol∕L）能明顯增加血管 平滑肌細胞HO-1 mRNA 的表達水平（P＜0.001；圖4A）；Western blot結果也顯示NRG 能明顯上調血管平滑肌細胞HO-1 蛋白的表達水平（P＜0.001；圖4B）。

圖4 NRG對大鼠血管平滑肌細胞HO-1表達水平的影響Fig.4 Effect of NRG on HO-1 expression in rat VSMCs

三組HO-1 mRNA 結果比較，經單因素方差分析，3 組間差異有統(tǒng)計學意義（F=248.488，P=0.000 02）；采用Turkey 法進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)CM 組與GM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.009），CM+NRG 組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 8）。

2.5 抑制HO-1 阻斷NRG 對血管平滑肌細胞鈣化的抑制作用

為了研究HO-1 是否參與了NRG 抑制血管平滑肌細胞鈣化的過程，我們觀察了HO-1 抑制劑ZnPP9 對NRG 抑制血管平滑肌細胞鈣化的影響。結果顯示（F=241.933，P=0.000 03）：與CM 組比較，NRG（20 μmol∕L）處理的細胞鈣化明顯減輕，加入ZnPP9（10-7mol∕L）能明顯阻斷NRG 對血管平滑肌細胞鈣化的抑制作用（圖5A、B）；另外，鈣定量分析顯示：ZnPP9能對抗NRG降低細胞鈣離子濃度的作用效應（圖5C）。

圖5 HO-1抑制劑ZnPP9對大鼠平滑肌細胞鈣化的影響Fig.5 Effect of HO-1 inhibitor ZnPP9 on calcification of rat VSMCs

四組定量分析茜素紅染色結果比較，經單因素方差分析，四組間差異有統(tǒng)計學意義（F=241.933，P=0.000 03）；采用Turkey法進一步作兩兩比較，發(fā)現(xiàn)CM 組與GM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 49），CM+NRG 組與CM 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 69），CM+NRG+ZnPP9 組與CM+NRG 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000 02）。

3 討論

慢性腎臟病血管鈣化臨床上尚無有效的治療方法，闡明血管鈣化的分子調控機制，尋找其干預靶點具有極其重要的臨床價值。在本研究中，我們采用平滑肌細胞和血管環(huán)鈣化模型，研究NRG 對血管鈣化的作用。結果顯示：不同濃度的NRG（5、10、20 μmol∕L）均可明顯減輕高磷高鈣誘導的大鼠血管平滑肌細胞和血管環(huán)鈣化。由于我們在研究NRG 對血管鈣化的作用時，采用了多個濃度NRG（5、10、20 μmol∕L）處理細胞和血管環(huán)，其中以NRG（20 μmol∕L）對血管鈣化的作用效果最佳。因此，在后續(xù)研究NRG 對HO-1 mRNA 和蛋白的表達水平的影響時，采用了20 μmol∕L 的NRG 處理細胞。NRG 降低細胞ROS 的水平，上調HO-1 的表達水平，而抑制HO-1可阻斷NRG 減輕血管平滑肌細胞鈣化的作用效應。這些結果提示：NRG 可通過誘導HO-1的表達抑制氧化應激和血管鈣化。

氧化應激的增強是許多血管鈣化相關疾病如慢性腎臟病、高血壓、糖尿病等的共同特征。慢性腎臟病血管鈣化的病理機制十分復雜，氧化應激是導致慢性腎臟病血管鈣化的重要發(fā)病機制［5］。在慢性腎臟病血管鈣化發(fā)展過程中，主動脈氧化應激程度明顯增加，而抑制氧化應激可改善動脈鈣化［13］。高磷水平能誘導ROS的產生和血管鈣化，抗氧化劑能明顯抑制氧化應激，延緩血管鈣化的發(fā)展［14］。本研究表明：高磷高鈣可刺激血管平滑肌細胞ROS 的水平升高，促進平滑肌細胞鈣化。使用NRG 后可明顯降低ROS 的水平，抑制血管平滑肌細胞和血管環(huán)鈣化。另外，既往研究表明：NRG 可通過促進HO-1 的表達發(fā)揮其抗氧化，抗細胞損傷等生物學作用［15-16］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)：NRG 可增加血管平滑肌細胞HO-1 的表達水平，抑制血管鈣化；而采用HO-1 抑制劑后，NRG 抑制平滑肌細胞鈣化的作用明顯減弱了。這些結果首次證實：NRG可通過調控HO-1抑制血管鈣化。

綜上所述，在鈣磷代謝失調的條件下，氧化應激可誘導血管鈣化。NRG 可上調HO-1 的表達水平，抑制氧化應激和血管細胞鈣化。調節(jié)HO-1 的表達水平可成為干預血管鈣化的新策略，我們將采用動物實驗進一步驗證NRG 通過調控HO-1 的表達抑制慢性腎臟病血管鈣化，為NRG 治療血管鈣化提供實驗依據。