張 華，孫慶德，王瑞芳，張 雯，張 鳳

（天津工業(yè)大學(xué)改性與功能纖維天津市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

石墨烯基季銨鹽的制備及其抗菌性能

張 華，孫慶德，王瑞芳，張 雯，張 鳳

（天津工業(yè)大學(xué)改性與功能纖維天津市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

為提高氧化石墨烯的抗菌性能，對(duì)其進(jìn)行功能化改性，包括羧基化改性（GO-COOH）和氨基化改性（AG），最終得到石墨烯基季銨鹽（GQAS）.通過(guò)透射電鏡、紅外光譜分析、X衍射、X光電子能譜對(duì)中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物進(jìn)行了表征，并通過(guò)紫外-可見(jiàn)光光譜儀和掃描電鏡等測(cè)試表征了GO、GO-COOH和GQAS對(duì)革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌的抗菌性能.結(jié)果表明：GQAS對(duì)大腸桿菌的抑菌率達(dá)到86.1%，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率達(dá)到95.3%，是一種有潛力的生物醫(yī)用材料.

石墨烯；季銨鹽；抗菌性能；功能化

石墨烯（GO）是一種由單層碳原子緊密堆積而成的2-D蜂窩狀材料，被認(rèn)為是富勒烯、碳納米管、石墨（Gt）的基本結(jié)構(gòu)單元[1].石墨烯可用于高速場(chǎng)效應(yīng)管（FET）包括隧道效應(yīng)三極管的器件材料、觸摸屏、低成本ID卡以及LED、OPV等光電器件，也可作為添加劑用于超級(jí)電容器和鋰離子電池電極材料，或作為增強(qiáng)劑用于復(fù)合材料[2].近期，上海應(yīng)用物理所物理生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室胡文兵等[3]報(bào)道了GO的抗菌特性，發(fā)現(xiàn)GO的抗菌性源自于它對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜的破壞，更重要的是GO對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的細(xì)胞毒性很小.隨后，伊朗謝里夫理工大學(xué)Akhavan等[4]進(jìn)一步研究了GO和還原石墨烯（rGO）對(duì)革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌的毒性作用.新加坡南洋理工大學(xué)的陳元教授報(bào)道了Gt、氧化石墨（GtO）、GO、rGO的抗菌性能和抗菌機(jī)理，并探討了膜壓和氧壓對(duì)其抗菌活性的影響[5].以上研究表明，石墨烯可以作為有效的新型抗菌材料.季銨鹽類(lèi)抗菌劑也是一種高效抗菌劑，其陽(yáng)離子吸引帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁，長(zhǎng)鏈烷基接觸到細(xì)菌細(xì)胞壁的另一側(cè)，作用于細(xì)菌細(xì)胞表層，破壞細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜.其作用方式有兩種：一種是長(zhǎng)鏈烷基破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁而殺死細(xì)菌；另一種是由于受抗菌劑陽(yáng)離子的吸引，細(xì)菌負(fù)電荷減少，繼而細(xì)胞壁破裂，內(nèi)溶物滲出而死[6].本文為進(jìn)一步提高GO的抗菌性能，通過(guò)改進(jìn)的Hummers法制備了氧化程度較高的GO，并對(duì)其進(jìn)行季銨鹽功能化改性.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器

所用藥品包括：石墨（Gt），8 000目，化學(xué)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，N，N-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU），分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；N，N-二甲基1，3-丙二胺，分析純，天津市化學(xué)試劑研究所產(chǎn)品；五氧化二磷，過(guò)硫酸鉀，濃硫酸（98%），高錳酸鉀，硝酸鈉，雙氧水（30%），鹽酸（36%～38%）等，上海試劑一廠(chǎng)產(chǎn)品；次氯酸，3-氯-1，2-丙二醇，鹽酸，蛋白胨，酵母浸粉等，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品.

所用儀器包括：UECIOR22型傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)BRUKER公司產(chǎn)品；K-alpha X型X射線(xiàn)光電子能譜儀，英國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品；JEM-2010FEF型透射電子顯微鏡，HitachiS-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本Nikon公司產(chǎn)品；D/MAX 2500型X射線(xiàn)衍射儀，日本Rigaku公司產(chǎn)品；TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司產(chǎn)品.

1.2 氧化石墨烯的制備

將40 mL濃硫酸加熱至90℃，在機(jī)械攪拌的同時(shí)加入8.4 g過(guò)硫酸鉀和8.4 g五氧化二磷，混合均勻后降溫至80℃，加入10 g Gt，恒溫水浴反應(yīng)4.5 h.將反應(yīng)物過(guò)濾，并用蒸餾水洗滌殘留的酸，置于真空烘箱于60℃烘干，得到預(yù)氧化石墨[7].

將5 g預(yù)氧化石墨加至130 mL濃硫酸（冰水?。┲?，機(jī)械攪拌反應(yīng)30 min；然后加入2 g NaNO3，待固體完全溶解后緩慢加入25 g高錳酸鉀，并將溫度升高至35℃，反應(yīng)90 min；用注射器加入230 mL蒸餾水，立即轉(zhuǎn)移到95℃油浴中反應(yīng)5 min，把混合物倒至2 000 mL的燒杯中滴加12.5 mL 30%雙氧水趁熱過(guò)濾，得到枯黃色固體；加入10%稀鹽酸10 mL，洗滌離心3遍，用蒸餾水洗滌至中性；將離心后固體放置于冷凍干燥機(jī)中干燥3 d，置于干燥器中保存[8-10].

1.3 羧基化石墨烯的制備

將100 mg GO分散于100 mL蒸餾水中，超聲處理1 h，得到均勻溶液.在GO懸浮液中加入1.2 g NaOH和1.0 g氯乙酸，水浴超聲2 h，加入適量的稀鹽酸得到均勻分散的水溶液[11].再經(jīng)過(guò)濾、水洗、干燥后得到GO-COOH.其化學(xué)反應(yīng)示意如下（其中用3個(gè)六圓環(huán)替代石墨烯片層）：

1.4 氨基化石墨烯（AG）的制備

將100 mg GO-COOH分散于100 mL DMF中，于30℃機(jī)械攪拌下超聲1 h，加入10 mL的N，N-二甲基1，3-丙二胺反應(yīng)1 h，加入10 mg的偶聯(lián)劑HATU，轉(zhuǎn)入60℃的水浴，冷卻回流6 h，用1 600 mL乙醇稀釋產(chǎn)物，過(guò)濾后得到AG[12-13].化學(xué)反應(yīng)示意如下：

1.5 石墨烯基季銨鹽（GQAS）的制備

將100 mg AG分散于100 mL蒸餾水中，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.5%的濃鹽酸.加入11 g3-氯-1，2-丙二醇，冷凝回流6～7 h.將得到的產(chǎn)物用水和乙醇交替洗滌3次，離心后得到產(chǎn)物[14].化學(xué)反應(yīng)示意如下：

1.6 結(jié)構(gòu)表征

針對(duì)干燥至恒重的Gt、GO、GO-COOH、AG和GQAS：在室溫下采用UECIOR22型傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）測(cè)試其400～4 000 cm-1吸收光譜；采用K-alpha X型X射線(xiàn)光電子能譜儀（XPS）分析其表面元素和含量；采用JEM-2010FEF型透射電子顯微鏡（TEM）觀(guān)察石墨烯形貌，加速電壓100 kV；采用D/ MAX-2500型X射線(xiàn)衍射儀對(duì)其進(jìn)行X射線(xiàn)衍射（XRD）分析，Cu靶Kα1線(xiàn)，波長(zhǎng)為0.154 18 nm，掃描速率為2°/min，掃描范圍（2θ）為3°～40°.

1.7 抗菌實(shí)驗(yàn)

（1）細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定.在固體瓊脂板上取單菌落，接種到預(yù)先添加有滅菌過(guò)的液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后放置在37℃恒溫振蕩儀中以140 r/min孵育24 h.取5 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，以10 000 r/min離心5 min，再用滅菌的生理鹽水清洗3次，重懸.將200 μL的懸濁液加入到新鮮的LB培養(yǎng)基中，使得菌液最終體積為100 mL，放置到37℃的恒溫?fù)u床中以140 r/ min培養(yǎng)，每隔2 h從三角瓶中取樣3 mL放入滅菌離心管中，放在4℃的冰箱中儲(chǔ)存.直至26 h后，采用TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)出所得到溶液的O.D. 600 nm值（波長(zhǎng)為600 nm的光密度值）[15-16].以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，O.D.600 nm值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn).

（2）抑菌率的測(cè)定.按照測(cè)生長(zhǎng)曲線(xiàn)的辦法培養(yǎng)細(xì)菌，取1 mL O.D.600=0.1的菌懸液分別和100 μL的無(wú)菌水（空白對(duì)照組）、抗菌劑混合后，接著轉(zhuǎn)移至15 mL的滅菌試管中，之后加入10 mL的液體培養(yǎng)基.在37.5℃、140 r/min條件下震蕩2 h.用200 μL稀釋10萬(wàn)倍處理后的菌懸液鋪平板，放置在37.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.采用HitachiS-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）觀(guān)察處理前后細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài).本實(shí)驗(yàn)中的抗菌劑有GO（20、50、100、250、500 μg/mL）、GO-COOH（100 μg/mL）、GQAS（100 μg/mL）的水溶液.空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)為加入100 μL的無(wú)菌水[17].抑菌率=（空白樣的菌落數(shù)-抗菌劑處理后的菌落數(shù)）/空白樣的菌落數(shù)×100%[18].

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)分析

圖1所示為各種功能化石墨烯的紅外光譜圖.

圖1 各種功能化石墨烯的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of GO，GO-COOH，AG and GQAS

由圖1可知，GO在3 430、1 725、1 650、1 100、1 050 cm-1處分別為O—H、C—O、C—C、C（O）O、C—C伸縮振動(dòng)峰.與GO相比，GO—COOH的C—OH峰強(qiáng)度減弱，C—O峰增強(qiáng)，且向高波數(shù)移動(dòng)，峰位置在1 760 cm-1處，說(shuō)明GO上的羥基向羧基轉(zhuǎn)變.AG在3 400 cm-1處出現(xiàn)N—H的伸縮振動(dòng)峰，2 924 cm-1處為甲基的C—H伸縮振動(dòng)峰，1 710 cm-1處為C—O鍵的伸縮振動(dòng)峰，1 350 cm-1處為新增的C—N伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明氨基化過(guò)程中形成了C—N共價(jià)鍵.GQAS在3 430 cm-1處出現(xiàn)O—H的伸縮振動(dòng)峰，2 924、2 850 cm-1處出現(xiàn)CH3和CH2的C—H伸縮振動(dòng)峰，1 710 cm-1處為C—O的伸縮振動(dòng)峰，1 350 cm-1為C—N的伸縮振動(dòng)峰，由此可知石墨烯基季銨鹽具有O—H、CH3、CH2、C—O、C—N等官能團(tuán).

圖2所示為各種功能化石墨烯的X光電子能譜圖.

圖2 Gt和各種功能化石墨烯的X光電子能譜圖Fig.2 XPS spectra of Gt，GO，GO-COOH，AG and GQAS

由圖2可知，在284.4、398.8和531.5 eV處的峰分別歸屬于碳、氮、氧的特征峰.Gt中氧碳質(zhì)量比為3.19/ 96.81，GO中氧碳質(zhì)量比為56.48/43.52，相比Gt而言其氧含量大幅度提高，這主要是因?yàn)镚O上具有豐富的羥基、羧基、環(huán)氧基等.GO-COOH中氧碳質(zhì)量比為61.05/38.42，其氧含量相對(duì)于GO中的氧含量有所增加，主要是由于GO上的羥基和環(huán)氧基部分轉(zhuǎn)化成了羧基. AG和GQAS相對(duì)于GO-COOH在398.8 eV處出現(xiàn)了氮的特征峰，氮含量分別為5.81%和4.34%，這主要是因?yàn)锳G上形成了C—N共價(jià)鍵，引入了N元素導(dǎo)致的.GQAS相對(duì)AG碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少，氧質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，主要是由于3-氯-1，2-丙二醇被成功地接枝，引入了羥基.

2.2 尺寸大小和晶體結(jié)構(gòu)

圖3所示為GQAS的透射電鏡圖片.

圖3 GQAS的透射電鏡圖Fig.3 TEM micrograph of GQAS

由圖3可以看出，GQAS層數(shù)較少且透明，卷曲褶皺，僅有幾個(gè)微米大小.

圖4所示為Gt和各種功能化石墨烯的XRD圖.

圖4 Gt以及功能化石墨烯的XRD曲線(xiàn)圖Fig.4 XRD patterns of Gt，GO，GO-COOH，AG and GQAS

由圖4可知，天然Gt在2θ=26.5°有個(gè)很強(qiáng)的特征衍射峰，是（002）晶面的特征衍射峰，其層間距為d=0.34 nm.GO的特征衍射峰出現(xiàn)在2θ=10.9°，其晶面間距明顯增大，為0.81 nm.這是由于濃硫酸的插層作用和高錳酸鉀的強(qiáng)氧化作用，使得其面上增加了大量羥基和環(huán)氧基等官能團(tuán)，面間距增大.GO-COOH的特征衍射峰出現(xiàn)在2θ=8.4°，晶面間距進(jìn)一步增大，為1.05 nm.AG和GQAS無(wú)特征衍射峰，主要是由于隨著鏈長(zhǎng)的進(jìn)一步增長(zhǎng)，石墨烯片層剝離得到寡層，層間呈無(wú)序排列.

2.3 抗菌性能

圖5所示為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖.

圖5 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖Fig.5 Growth curve of E.coli and S.aureus

由圖5可知,大腸桿菌4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)區(qū)間為4～14 h.與之相對(duì)應(yīng)的金黃色葡萄球菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期的時(shí)間是6 h，16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)區(qū)間為6～16 h.

圖6所示為經(jīng)過(guò)無(wú)菌水、GO、GO-COOH、GQAS等試劑處理后大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的平板計(jì)數(shù)圖.

圖6 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)圖Fig.6 Plate count photographs of E.coil and S.aureus

由圖6可知，處理前大腸桿菌的數(shù)目為166個(gè)，經(jīng)過(guò)GO、GO-COOH、GQAS處理后菌數(shù)分別為105、51和23個(gè)，得出GO、GO-COOH、GQAS的抑菌率分別為36.7%、69.3%和86.1%；處理前金黃色葡萄球菌的數(shù)目為212個(gè)，經(jīng)過(guò)GO、GO-COOH、GQAS處理后菌數(shù)分別為100、46和10個(gè)，得出GO、GO-COOH、GQAS的抑菌率分別為52.8%、78.3%、95.3%.由此可知，羧基化石墨烯的抗菌性能大于GO，可能是因?yàn)槠浠钚匝醯暮扛哂贕O，更能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；而石墨烯基季銨鹽的抗菌性能高于GO和羧基化石墨烯，是因?yàn)槭┗句@鹽具有可破壞細(xì)菌壁的季銨鹽支鏈.

圖7所示為用GQAS處理大腸桿菌和金黃色葡萄球菌前后的掃描電鏡圖.

圖7 GQAS處理前后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的掃描電鏡圖Fig.7 SEM images of E.coli and S.aureus before and after having been treated with GQAS

由圖7可以看出，處理前大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，處理后細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)遭到破壞，特別是金黃色葡萄球菌，幾乎全部細(xì)胞都遭到破壞.這主要是因?yàn)槭┢瑢蛹怃J的邊緣破壞細(xì)胞膜，季銨鹽的陽(yáng)離子吸引帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁，破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁從而殺死細(xì)菌.

3 結(jié) 論

本文以水溶性HATU為偶聯(lián)劑成功制備了AG，同時(shí)，制備了高效的碳納米抗菌劑—GQAS，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和抗菌性能分析，研究結(jié)果表明：

（1）隨著接枝的官能團(tuán)越多、越長(zhǎng)，功能化石墨烯的層間距也逐漸增大，氨基化石墨烯和石墨烯季銨鹽片層之間是無(wú)序堆疊的.

（2）無(wú)論是對(duì)大腸桿菌還是金黃色葡萄球菌，抑菌率大小排序?yàn)椋菏┘句@鹽>羧基化石墨烯>GO.

（3）石墨烯基季銨鹽對(duì)大腸桿菌的抑菌率達(dá)到86.1%，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率達(dá)到95.3%，其抗菌性能遠(yuǎn)高于GO和羧基化石墨烯.

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Fabrication and antibacterial activity of graphene based quaternary ammonium salt

ZHANG Hua，SUN Qing-de，WANG Rui-fang，ZHANG Wen，ZHANG Feng
（Tianjin Municipal Key Laboratory of Fiber Modification and Functional Fiber，Tianjin Polytechnic University，Tianjin 300387，China）

Graphene based quaternary ammonium salt（GQAS）has been fabricated through a series of derivative of graphene such as carboxylated graphene oxide（GO-COOH），amino-functionalization graphene oxide（AG）in the aim of enhancing the antibacterial properties of graphene oxide.The different functionalized GO were characterized by transmission electron microscope（TEM），F(xiàn)ourier-transform infrared（FT-IR）spectroscopy，X-ray diffraction（XRD）and X-ray photoelectron spectroscopy（XPS）.The antibacterial activity to Gram-negative Escherichia coli（E.coli）and Gram-positive Staphylococcus aureus（S.aureus）of GO，GO-COOH and GQAS were compared by UV-Vis spectrometer and scanning electron microscope （SEM）.The results indicated that the antibacterial rates of GQAS are 86.1% and 95.3% to E.coli and S.aureus，respectively.So GQAS is a promising new material for biological and medical applications.

graphene；quaternary ammonium salt；antibacterial activity；functionalization

O613.71；TQ455

A

1671-024X（2015）02-0043-05

2014-12-23

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（13JCZDJC32100）

張 華（1961—），女，博士，教授，研究方向?yàn)榭咕{米材料.E-mail：hua1210@126.com