羅明志 曾慧龍 潘 艷 劉 磊 鄧林紅 商 澎

碳納米管（CNT）獨特的力學及化學性質使其在材料、信息、能源及生物醫(yī)學等領域都有巨大的應用價值［1－3］。隨著CNT的廣泛應用，其生物安全性也引起廣泛關注［4］。CNT進入人體后在體內駐留時間長達90 d。有研究［5］表明，CNT可誘導小鼠肺部炎癥和纖維化。CNT進入人體后會在骨組織富集，而在大量骨組織工程材料中加入CNT［6］，可增加其力學性能，但CNT對成骨細胞功能的影響有待進一步研究［7］。

基于多壁碳納米管（MWCNT）的剛性特性，它吸附至細胞膜表面必將影響細胞膜剛度和流動性，從而改變細胞生物力學特性。而細胞運動過程涉及細胞骨架重構和細胞膜流動，細胞生物力學特性對該過程具有重要影響。因此，本實驗中我們假設MWCNT吸附可影響細胞的遷移特性，研究MWCNT分散方法，并通過原子力顯微鏡和劃痕實驗探究MWCNT分散對成骨細胞吸附及細胞遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 MWCNT分散

MWCNT購自南京先豐納米材料科技有限公司，直徑8～15 nm，長度50 m。采用掃描電鏡觀察MWCNT未分散時的形態(tài)及其元素組成和含量，采用含0.6%牛血清白蛋白（BSA）的最低營養(yǎng)培養(yǎng)基（MEM）懸浮 MWCNT，采用超聲波細胞破碎儀（40 W）超聲分散 MWCNT5 min（超聲分散3秒，間隔3秒），采用動態(tài)光散射儀和投射電鏡評價其分散情況。

1.2 細胞培養(yǎng)

將小鼠MC3T3－E1成骨細胞（購自中國科學院上海細胞庫）培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）（美國Hyclone公司）、雙抗（青霉素、鏈霉素，100 IU／mL）的MEM培養(yǎng)基中，置于含5%CO2、飽和水蒸汽的培養(yǎng)箱（37℃）中培養(yǎng)。

1.3 劃痕實驗

收集 MC3T3－E1細胞，以8×104個／cm2接種至六孔板，12 h后用白色槍頭劃線，磷酸鹽緩沖液洗滌3次后添加MEM，加入MWCNT分散液（終濃度100 g／mL）后置入活細胞工作站（德國Leica公司）培養(yǎng)，每隔5 min拍照。隨機選取30個細胞，用Gradientech Tracking分析系統(tǒng)對MC3T3－E1細胞的遷移距離、速度和方向進行分析。

1.4 原子力顯微鏡觀察

采用輕敲模式原子力顯微鏡（德國JPK公司）在空氣中對細胞進行掃描。初始掃描范圍為100 m×100 m，然后縮小掃描范圍至10 m×10 m，觀測細胞表面的微觀結構，記錄原子力顯微鏡三維圖。

1.5 統(tǒng)計學分析

全部數(shù)據(jù)采用Prism5.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，結果以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗比較實驗組與對照組之間差異，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MWCNT分散及表征

采用掃描電鏡觀察 MWCNT粉體（圖1a）純度、長度和寬度等基本參數(shù)，能譜分析結果顯示MWCNT的主要元素為碳和氧，含量達95%（表1），直徑15 nm，長度為50 m（圖1b）。將經超聲波處理的MWCNT分散液放置于4℃環(huán)境中2周，結果無明顯沉淀（圖1c），動態(tài)光散射儀檢測結果為（180.20±16.23）nm。投射電鏡觀察發(fā)現(xiàn) MWCNT分散較好，但其長度明顯變短（圖1d）。

表1 MWCNT掃描電鏡能譜分析結果

表1 MWCNT掃描電鏡能譜分析結果

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圖1 MWCNT顆粒及其分散后的形態(tài) a、b.未分散的MWCNT c.MWCNT分散液 d.分散的MWCNT

2.2 MWCNT對細胞遷移的影響

采用劃痕實驗檢測MWCNT對成骨細胞遷移的影響，光學顯微鏡（×10）觀察發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MWCNT處理組劃痕區(qū)域遷入細胞較少（圖2a～2d）。采用Image Pro Plus 6.0軟件對其空白區(qū)域面積進行分析，結果顯示對照組愈合率為80%，而MWCNT處理組愈合率為45%（P＜0.01）。

圖2 采用劃痕實驗檢測MWCNT對成骨細胞遷移的影響，光學顯微鏡觀察對照組、MWCNT處理組在0h（a、b）和12 h（c、d）時的細胞遷移（標尺＝100 m）

采用Gradientech Tracking軟件對細胞的遷移特性進行分析，結果顯示與對照組相比（圖3a），MWCNT處理組細胞遷移距離明顯較少（圖3b），其遷移距離從 172.52 m 下降至 129.80 m（P＜0.01），直線距離從（88.50±11.65）m 下降至（55.20±8.50）m （P ＜ 0.01），遷 移 速 度 從0.3 m／min下降至0.2 m／min（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。

2.3 MWCNT對成骨的吸附特性

MWCNT處理 MC3T3－E1成骨細胞12 h后，原子力顯微鏡觀察細胞表面形態(tài)，結果顯示細胞表面依然吸附大量的MWCNT（圖4）。

圖3 采用Gradientech Tracking軟件分析細胞遷移特性，對照組（a）與 MWCNT處理組（b）細胞遷移軌跡

圖4 原子力顯微鏡檢測MWCNT對成骨細胞的吸附作用 a.對照組 b.MWCNT處理組

3 討論

體內外實驗研究［8－9］表明，MWCNT 的分散特性對其生物學效應具有根本性影響。用于細胞實驗的MWCNT分散方法是目前研究的熱點，基礎培養(yǎng)液、完全培養(yǎng)基、表面活性劑等被用于分散MWCNT［10－11］。本實驗采用含0.6%BSA 的完全培養(yǎng)基分散MWCNT，動態(tài)光散射儀和投射電鏡觀察顯示分散效果較好，但投射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)分散后MWCNT長度為1 m以下，提示超聲分散可顯著降低MWCNT長度。

MWCNT對成骨細胞的影響已有報道［12］。研究表明，在未修飾的MWCNT表面可直接培養(yǎng)細胞［13］，在細胞外基質或組織工程支架材料中添加MWCNT可促進成骨細胞分化和骨損傷修復［14］。但溶液中分散的MWCNT對成骨細胞遷移特性的影響研究少見報道。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，100 g／mL的MWCNT可顯著抑制成骨細胞遷移，進一步分析顯示細胞遷移距離降低，遷移速度下降。

MWCNT對細胞毒性作用的機制已有大量報道，其中氧化應激機制是其重要途徑，但也有研究表明MWCNT對細胞的吸附可能也會影響細胞的生理功能。CNT可誘導腫瘤細胞原癌基因c－Myc表達，從而抑制ABC轉運蛋白表達，但這種作用可能不是通過氧化應激發(fā)生作用，而是通過與細胞膜相互作用引起［10］。有研究［15］表明，MWCNT 可引起細胞骨架解聚，導致細胞膜重構。在本實驗中，MWCNT大量吸附于細胞表面，而CNT可改變細胞膜剛度［16］，因此我們推測 MWCNT可能通過吸附作用改變細胞生物力學特性，從而影響細胞遷移，但具體機制有待進一步研究。

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