婁振凱 羅旺 李興國 趙學(xué)凌 王兵

H2O2、LPS和TNF-α誘導(dǎo)人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的實驗研究

婁振凱 羅旺 李興國 趙學(xué)凌 王兵

目的 探討人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型建立方法，為體外研究血管內(nèi)皮細(xì)胞提供實驗基礎(chǔ)。方法 分離培養(yǎng)人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，分別采用不同濃度的過氧化氫(H2O2)、脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子(TNF)-α刺激細(xì)胞，孵育不同時間后，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細(xì)胞活力(OD值)。結(jié)果 各濃度H2O2損傷組較對照組OD值顯著降低(P<0.01)，不同濃度H2O2損傷組間OD值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。0.1 μg/mL LPS損傷組與對照組OD值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；其余各濃度LPS損傷組較對照組OD值顯著降低(P<0.05)，且LPS濃度在一定范圍內(nèi)，OD值隨LPS濃度的增加及作用時間的延長而降低，具有一定的濃度與時間依賴性。各濃度TNF-α損傷組較對照組OD值顯著降低(P<0.01)，且TNF-α濃度在一定范圍內(nèi)，OD值隨TNF-α濃度的增加及作用時間的延長而降低，具有一定的濃度與時間依賴性。結(jié)論 H2O2、LPS和TNF-α能體外損傷人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，成功建立人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，且在一定濃度范圍內(nèi)各損傷因子對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度呈濃度和時間依賴性。

過氧化氫；脂多糖；腫瘤壞死因子-α；人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

深靜脈血栓(DVT)是血液在深靜脈內(nèi)不正常凝結(jié)引起的靜脈回流障礙性疾病，多發(fā)生于下肢[1]。血栓脫落可引起肺動脈栓塞(PE)，是骨科圍手術(shù)期死亡的主要原因之一，也是醫(yī)院內(nèi)非預(yù)期死亡的重要原因[2]。氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化及炎癥反應(yīng)是誘導(dǎo)靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷、活化、黏附，促使凝血與抗凝、纖溶與抗纖動態(tài)失衡，從而促進DVT形成的重要原因。但其具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及分子調(diào)控機制尚不完全清楚，缺乏可靠、穩(wěn)定的體外研究模型是主要原因之一。為此，本研究采用過氧化氫(H2O2)、脂多糖(LPS)和腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導(dǎo)人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷以建立靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，旨在為體外研究靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能變化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞及試劑

人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由江陰齊式生物技術(shù)有限公司提供。實驗試劑包括0.25%的乙二胺四乙酸(EDTA)-胰酶(Hyclone公司)、高糖Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Hyclone公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

棄去培養(yǎng)液，用0.25% EDTA-胰酶對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在37℃下消化1 min，小心吸出胰酶，加入新鮮的高糖DMEM培養(yǎng)基終止胰酶反應(yīng)并反復(fù)吹打直至細(xì)胞脫落分散，將細(xì)胞懸液分別接種于3個培養(yǎng)瓶中，補充培養(yǎng)基至每瓶4 ml，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 建立人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型

將培養(yǎng)的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞濃度調(diào)至2×104個/mL，接種于3個96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，第1個培養(yǎng)板隨機分成8組，每組取3個孔，即0 μmol/L H2O2組(對照組)、20 μmol/L H2O2損傷組、40 μmol/L H2O2損傷組、60 μmol/L H2O2損傷組、80 μmol/L H2O2損傷組、200 μmol/L H2O2損傷組、400 μmol/L H2O2損傷組、1 000 μmol/L H2O2損傷組，孵育4、12、24 h后，采用MTT法檢測各組細(xì)胞活性。用上述同樣方法，第2個培養(yǎng)板隨機分成7組，每組取3個孔，即0 μg/mL LPS組(對照組)、0.1 μg/mL LPS損傷組、1 μg/mL LPS損傷組、5 μg/mL LPS損傷組、10 μg/mL LPS損傷組、20 μg/mL LPS損傷組、50 μg/mL LPS損傷組，孵育4、12、24 h后，采用MTT法檢測各組細(xì)胞活性。用上述同樣方法，第3個培養(yǎng)板隨機分成8組，每組取3個孔，即0 ng/mL TNF-α組(對照組)、5 ng/mL TNF-α損傷組、10 ng/mL TNF-α損傷組、20 ng/mL TNF-α損傷組、40 ng/mL TNF-α損傷組、60 ng/mL TNF-α損傷組、80 ng/mL TNF-α損傷組、100 ng/mL TNF-α損傷組，孵育4、12、24 h后，采用MTT法檢測各組細(xì)胞活性。

1.2.3 MTT檢測

采用5 mL MTT溶劑溶解25 mg MTT，配制成MTT溶液5 mg/mL。每孔加入10 μL MTT溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan溶解液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan溶解液全部溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔吸光值(OD值)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用方差分析及SNK法進行統(tǒng)計學(xué)處理。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

各濃度H2O2損傷組OD值較對照組明顯降低(P<0.01)，各濃度H2O2損傷組不同作用時間點OD值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 不同濃度H2O2在不同作用時間點對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

2.2 LPS對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

除0.1 μg/mL LPS損傷組與對照組OD值無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)外，其余各濃度LPS損傷組OD值較對照組顯著降低(P<0.05)；LPS濃度為1～10 μg/mL時，隨著LPS濃度的增加OD值呈降低趨勢(P<0.05)；作用時間為4～12 h時，隨著作用時間的延長，各濃度LPS損傷組OD值呈降低趨勢(P<0.05)(圖2)。因此，在一定范圍內(nèi)，LPS對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷呈濃度與時間依賴性。

2.3 TNF-α對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

各濃度TNF-α損傷組較對照組OD值明顯降低(P<0.01)。TNF-α濃度為5～60 ng/mL時，隨著TNF-α濃度的增加，OD值呈降低趨勢(P<0.05)；作用時間為12～24 h時，隨著作用時間的延長，各濃度TNF-α損傷組OD值呈降低趨勢(P<0.05)(圖3)。因此，在一定范圍內(nèi)，TNF-α對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷呈濃度與時間依賴性。

圖2 不同濃度LPS在不同作用時間點對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

圖3 不同濃度TNF-α在不同作用時間點對人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

3 討論

DVT是骨科最常見的并發(fā)癥，美國每年DVT和PE患病率約為35萬～60萬，我國每年約為1 000萬[3]。創(chuàng)傷或骨科大手術(shù)后DVT發(fā)生率高達40%～85%，其中髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后DVT發(fā)生率約為42%～57%，膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后DVT發(fā)生率約為41%～85%，髖部骨折手術(shù)后DVT發(fā)生率約為46%～60%[4]。全球每年因DVT死亡的人數(shù)超過1 500萬，我國約為100萬[3]，死亡原因主要為PE。然而，目前DVT的診斷主要依靠臨床癥狀、體征、影像學(xué)檢查和實驗室檢查相結(jié)合，待血栓形成才能明確診斷，無法早期預(yù)測診斷，難以及時有效防治。究其原因，DVT形成受多因素、復(fù)雜機制調(diào)控, 具體分子機制仍不完全清楚，其機制可能包括致病基因(基因缺陷)，基因突變及基因間相互影響、炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子相互作用，凝血(抗凝)、纖溶(抗纖)、血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常等，其中氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)等假說是目前研究的熱點，而血管內(nèi)皮細(xì)胞在DVT形成過程中起至關(guān)重要的作用。因此，建立穩(wěn)定、可靠的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型是體外研究DVT形成分子機制的先決條件。目前主要有3種建立靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型的方法，即分別采用不同濃度的H2O2、LPS、TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞，根據(jù)實驗要求選用最合適的模型[5-7]。本實驗分別采用不同濃度梯度的H2O2、LPS、TNF-α分別與人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作用不同時間以建立靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，為體外研究靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在DVT發(fā)病機制中的作用提供實驗依據(jù)。

本實驗結(jié)果顯示各濃度H2O2損傷組人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力較對照組明顯降低，且H2O2與人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力無濃度和作用時間依賴性。劉立新等[8]研究顯示，H2O2能誘導(dǎo)人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，且隨著H2O2濃度的增加，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率也增加，在一定范圍內(nèi)呈量-效關(guān)系。該研究結(jié)果與本實驗研究結(jié)果有差異，這可能與實驗試劑、方法及所用的實驗儀器有關(guān)。本實驗所采用的H2O2濃度為20～400 μmol/L，作用時間為4、12、24 h，與Uberti等[9]的研究(H2O2濃度為200 μmol/L)有共同之處，但與Chen等[10](H2O2濃度為500 μmol/L)、Wang等[11](H2O2濃度為2 mmol/L)的研究有所差別。而本研究證實，靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度與H2O2無濃度和作用時間依賴性。

本實驗結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)隨著LPS、TNF-α濃度的增加及作用時間的延長，靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力降低，靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度與LPS、TNF-α呈一定的濃度與時間依賴性。本實驗所選用的LPS濃度為0.1～50 μg/mL，TNF-α濃度為5～100 ng/mL，作用時間均為4、12、24 h，與Wu 等[12](LPS濃度為1 ng/mL，作用時間為4 h)、Li等[13](LPS濃度為0.2 ng/mL，作用時間為24 h)和呂自明等[14](TNF-α濃度梯度為5～80 ng/mL，作用時間為4 h)、Li等[15](TNF-α濃度為10 ng/mL，作用時間為4 h)建立此模型所選擇的濃度和時間有共同之處。本實驗的優(yōu)點為充分考慮了誘導(dǎo)劑濃度及作用時間對此模型的影響。然而，本研究也存在一些不足，若要想盡可能減小實驗誤差，應(yīng)選取更多的濃度梯度與不同作用時間及采用更多的方法檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡程度，并對其結(jié)果進行綜合分析。

綜上所述，本研究證實不同濃度的誘導(dǎo)劑及與人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作用不同時間所建立的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型是有差異的，因此在建立此模型時，應(yīng)綜合考慮該試劑的濃度及與細(xì)胞作用的時間，盡可能選用不同原理的儀器對細(xì)胞進行活力檢測和凋亡率測定，從而選擇較好的模型。

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(收稿：2015-03-27；修回：2015-04-28)

(本文編輯：盧千語)

H2O2、LPS and TNF-α induced injury of human umbilical vein endothelial cells

LOU Zhen-kai, LUO Wang, LI Xing-guo, ZHAO Xue-ling, WANG Bing． Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, China

WANGBingE-mail:wbdoctor@hotmail.com

Objective To investigate the method of establishing human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) injury model, and to provide experimental basis for the research of vascular endothelial cells in vitro. Methods HUVECs were separated and cultured, the hydrogen peroxide (H2O2), lip polysaccharide (LPS) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) with different concentrations were used to induce the cell damage. MTT assay was used to determine the vitality of cells (OD value)at different time interval. Results OD value of H2O2damage groups was significantly lower than that of normal control group (P<0.01). No significant differences were found among H2O2damage groups (P>0.05). No significant differences were found between 0.1 μg/mL LPS damage group and normal control group (P>0.05). OD value of the other LPS damage groups was significantly lower than that of normal control group (P<0.05). The effect of LPS on HUVECs was time and concentration dependent within a certain range. OD value of TNF-α damage groups was significantly lower than that of normal control group (P<0.01). The effect of TNF-α on HUVECs was time and concentration dependent within a certain range. Conclusion The injury model of HUVECs could be induced by H2O2, LPS and TNF-α in vitro.

Hydrogen peroxide；Lip polysaccharide；Tumor necrosis factor-alpha；Human umbilical vein endothelial cell

國家自然科學(xué)基金(81160236)

650032， 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科

王兵 E-mail: wbdoctor@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7083.2015.03.010