張昆麗 ,謝芝勛，黃 莉，謝麗基，劉加波，鄧顯文，謝志勤，范 晴，羅思思

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004； 2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

研究論文

禽呼腸病毒感染對(duì)SPF雞外周血T細(xì)胞亞型變化和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的影響

張昆麗1,謝芝勛2*，黃 莉2，謝麗基2，劉加波2，鄧顯文2，謝志勤2，范 晴2，羅思思2

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004； 2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

為探討禽呼腸病毒(ARV)對(duì)SPF雞外周血淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量變化和細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響，利用流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別測(cè)定了ARV感染后1、7、14、21、28、35 d感染組和對(duì)照組SPF雞外周血淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)胞含量和細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄時(shí)相。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，SPF雞感染ARV后7 d和14 d CD4+、CD8+T細(xì)胞比值高于對(duì)照組，其中感染7 d，CD8+T細(xì)胞含量差異顯著(P<0.05)；感染后1、21、28、35 d感染組CD4+、CD8+T細(xì)胞比值均低于對(duì)照組，感染1 d后CD4+、CD8+T細(xì)胞含量均差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明外周血T細(xì)胞亞型變化是ARV感染的重要表現(xiàn)之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，感染組外周血淋巴細(xì)胞中IL-1β、IL-6(除7 d外)、IL-18(除14 d外)和TNF-α在整個(gè)感染過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，IL-17和IFN-γ除感染1 d外，均表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ和TNF-α均參與了ARV的感染進(jìn)程。

禽呼腸病毒;細(xì)胞因子;轉(zhuǎn)錄水平;流式細(xì)胞術(shù);外周血淋巴細(xì)胞

禽呼腸病毒(Avian reovirus, ARV)屬呼腸病毒科、正呼腸病毒屬的成員，可感染雞、火雞、鴨、鵝及野鳥(niǎo)等多種禽類(lèi)[1]。目前，ARV廣泛分布于世界各地，自20世紀(jì)80年代中期開(kāi)始我國(guó)各地相繼分離到ARV。ARV感染導(dǎo)致雞群生長(zhǎng)緩慢，生產(chǎn)性能下降，免疫抑制，從而導(dǎo)致疫苗免疫失敗，各種細(xì)菌性病毒性疾病的繼發(fā)感染給全球養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

CD3是所有T細(xì)胞的表面標(biāo)志，CD4則是輔助T細(xì)胞(Th)和效應(yīng)T細(xì)胞的表面標(biāo)志，Th細(xì)胞包括Th0、Th1、Th2、Th17亞群，具有輔助、誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫的作用，Th通過(guò)釋放多種細(xì)胞因子輔助B細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞活化，上調(diào)機(jī)體的免疫功能；CD8是細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL或 Tc)和抑制T細(xì)胞(Ts)的表面標(biāo)志，細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)在清除病原和導(dǎo)致病理?yè)p傷過(guò)程中起重要作用，抑制T細(xì)胞(Ts)通過(guò)釋放抑制因子抑制B細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞活化，下調(diào)機(jī)體的免疫功能。多種禽類(lèi)病毒性疾病研究表明，病毒感染可導(dǎo)致T細(xì)胞亞型變化和細(xì)胞因子表達(dá)水平異常，如馬立克病毒感染可導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯增加[2]和IFN-γ表達(dá)量增加[3]；H5N1亞型禽流感病毒可引起“細(xì)胞因子風(fēng)暴”效應(yīng)和激發(fā)體內(nèi)CD4+、CD8+T細(xì)胞異常表達(dá)并參與病理?yè)p傷[4]；IBV感染可導(dǎo)致氣管黏膜組織多種細(xì)胞因子被局部激活[5]。但目前對(duì)ARV的研究主要是病原分離鑒定、病毒全基因測(cè)序、臨床檢測(cè)試劑盒開(kāi)發(fā)等[6-7]，對(duì)禽呼腸病毒的致病機(jī)制研究相對(duì)較少，目前尚未見(jiàn)ARV感染對(duì)雞外周血T細(xì)胞亞型變化及細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的相關(guān)研究。本研究通過(guò)建立禽呼腸病毒的人工感染SPF雞動(dòng)物模型，分別利用流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法測(cè)定分析ARV感染后不同時(shí)間段SPF雞外周血淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)胞含量和細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，探討T細(xì)胞亞型和細(xì)胞因子變化在禽呼腸病毒感染的過(guò)程中的作用，為禽呼腸病毒致病機(jī)理的進(jìn)一步闡述奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 Gallios三激光10色流式細(xì)胞儀為BackMan公司產(chǎn)品；Lightcycler 2.0熒光定量PCR儀為Roche公司產(chǎn)品；RNA提取試劑Trlzol LS Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、RNA抑制劑、RNA/DNA樣品保護(hù)液、SYBR○RPremix ExTaqⅡ等為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 病毒和試驗(yàn)用動(dòng)物 禽呼腸病毒S1133標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株(ARV-S1133)為中國(guó)獸藥監(jiān)察所產(chǎn)品；SPF雞胚為北京梅里亞公司產(chǎn)品，購(gòu)買(mǎi)后在實(shí)驗(yàn)室人工孵化，并在SPF隔離器中飼養(yǎng)至試驗(yàn)結(jié)束。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理和樣品采集 7日齡SPF雛雞62只隨機(jī)分成2組，每組31只。ARV感染組：雙側(cè)足墊注射ARV-S1133病毒0.2 mL/只(約為104個(gè)TCID50)；對(duì)照組：雙側(cè)足墊注射無(wú)菌PBS，0.2 mL/只。感染組和對(duì)照組在隔離器中分開(kāi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件相同。每組分別于感染后1、7、14、21、28、35 d隨機(jī)取5只雞，經(jīng)翼靜脈各采集外周血1 mL，肝素鈉抗凝，并將采血后的試驗(yàn)雞清除試驗(yàn)組。翼靜脈抗凝血的處理參照淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)，分離得到雞外周血淋巴細(xì)胞。

1.2.2 外周血淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)胞含量的檢測(cè) 參照淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明，制備濃度為1×106個(gè)/mL的雞外周血淋巴細(xì)胞懸液。參照試劑說(shuō)明，染色標(biāo)記。24 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)感染組和對(duì)照SPF雞外周血淋巴細(xì)胞中CD4+、CD8+T細(xì)胞的含量。每組檢測(cè)5個(gè)樣品，設(shè)置每份樣品獲取10 000個(gè)細(xì)胞，獲取淋巴細(xì)胞陽(yáng)性百分比。

1.2.3 RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄 分離得到外周血淋巴細(xì)胞，加入750 μL Trizol裂解。參照Trizol LS Reagent使用說(shuō)明書(shū)分別提取感染組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的組織樣品RNA。抽提完后加入DEPC水35.0 μL、反轉(zhuǎn)錄引物1.5 μL；70 ℃ 10 min；冰浴5 min；加入反轉(zhuǎn)錄體系：5×Prime Script 10 μL、dNTP 2 μL 、RNA酶抑制劑0.5 μL、Prime Script Reverse Transcriptase 1 μL，瞬時(shí)離心，42 ℃水浴90 min；95 ℃水浴5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，制備的cDNA置-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，內(nèi)參基因GAPDH為對(duì)照，用已建立的各細(xì)胞因子real-time PCR檢測(cè)方法[8-9]測(cè)定組織中各細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α)和內(nèi)參基因GAPDH的Ct值。每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，試驗(yàn)組對(duì)照組各取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)3次。1.2.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)用Backman Coulter的配機(jī)軟件分析淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果，并用Excel制圖；real-time PCR后，獲得目的基因和內(nèi)參基因GAPDH的Ct值。以GAPDH為參照，采用2-ΔΔCT法計(jì)算各基因在不同時(shí)相的相對(duì)表達(dá)量，用GraphPad Prism 6制圖，所有結(jié)果用Excel進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 ARV感染后試驗(yàn)雞外周血中CD4+T細(xì)胞的變化

分離得到的外周血淋巴細(xì)胞用CD4+FITC單抗染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+T細(xì)胞數(shù)量，檢測(cè)分析結(jié)果如圖1所示。SPF雞感染禽呼腸病毒感染后7 d和14 d后CD4+T細(xì)胞比值高于對(duì)照組(P<0.01)，表明感染7 d～14 d是機(jī)體清除ARV的主要時(shí)期；感染后1、21、28、35 d感染組CD4+T細(xì)胞比值均低于對(duì)照組，其中感染1 d和21 d后差異顯著(P<0.05)表明ARV可抑制感染后期CD4+T細(xì)胞的分化。

圖1 外周血中CD4+T細(xì)胞含量的變化Fig.1 The changes of CD4+T cell levels in peripheral blood

2.2 ARV感染后試驗(yàn)雞外周血CD8+T細(xì)胞的變化

分離得到的外周血淋巴細(xì)胞用CD8+FITC單抗染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD8+T細(xì)胞數(shù)量，檢測(cè)分析結(jié)果如圖2所示。SPF雞感染禽呼腸病毒感染1 d，由于機(jī)體對(duì)病毒入侵的急性抗病毒反應(yīng)和應(yīng)激作用，血液中的CD8+T細(xì)胞顯著低于對(duì)照組，且差異顯著(P<0.05)；由于病毒的持續(xù)性作用，感染后7 d和14 d，使得血液中CD8+T細(xì)胞含量升高，且與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；感染21、28、35 d，血液中CD8+T細(xì)胞含量與對(duì)照組相比均下降，但差異不顯著(P>0.05)，這可能與機(jī)體的全身性免疫調(diào)節(jié)和對(duì)病毒的免疫耐受相關(guān)。

2.3 試驗(yàn)雞外周血中6種細(xì)胞因子表達(dá)的變化

雞感染ARV-S1133株后1、7、14、21、28、35 d后，細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α在外周血白細(xì)胞中的表達(dá)變化如圖3所示。結(jié)果表明，IL-1β和TNF-α在整個(gè)感染過(guò)程中均保持均一水平(約1.5倍)；IL-17和IFN-γ在感染后1 d分別上調(diào)3.23倍和1.67倍，感染7 d后IL-17和IFN-γ mRNA表達(dá)量均下調(diào)；IL-6除感染14 d外均表達(dá)上調(diào)；IL-18在外周血白細(xì)胞中的變化最為明顯，尤其是感染后1、14和28 d，其mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比分別上調(diào)24.11、16.40、5.82倍(P<0.05)。

圖2 外周血中CD8+T細(xì)胞量的變化Fig.2 The changes of CD8+T cell levels in peripheral blood

圖3 ARV感染SPF雞外周血中各細(xì)胞因子基因mRNA的相對(duì)動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄時(shí)相Fig.3 Relative transcription dynamic phases of cytokine gene mRNA in ARV-infected SPF chickens

3 討論

CD4、CD8是參與T細(xì)胞識(shí)別、黏附和活化過(guò)程的主要CD分子之一。CD4+T細(xì)胞稱(chēng)為輔助性T細(xì)胞，包括Th0、Th1和Th2亞群。Th細(xì)胞的抗病毒作用在機(jī)體的病毒免疫機(jī)制中十分重要。CD4分子是MHC Ⅱ類(lèi)分子限制的T細(xì)胞TCR識(shí)別抗原的輔助受體，當(dāng)ACP遞呈與MHC Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合的非自身抗原肽(如病毒肽)時(shí)，激活CD4+T細(xì)胞。激活后的CD4+T細(xì)胞可輔助B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，啟動(dòng)免疫反應(yīng)[10]。CD4+T細(xì)胞含量高時(shí)，表明機(jī)體免疫功能強(qiáng)，不易被病原體感染，當(dāng)外源性病原微生物侵入體內(nèi)能很快啟動(dòng)免疫反應(yīng)，對(duì)抗和清除病原。研究結(jié)果表明，SPF雞感染禽呼腸病毒感染后21、28、35 d感染組CD4+T細(xì)胞比值均低于對(duì)照組，且IL-17和IFN-γmRNA也表達(dá)下調(diào)，表明在ARV感染后期CD4+T細(xì)胞活化受到抑制，并可能進(jìn)一步抑制Th細(xì)胞的分化，導(dǎo)致Th1典型細(xì)胞因子IFN-γ和Th17細(xì)胞因子IL-17表達(dá)下調(diào)；CD4+水平降低，且具有促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生促進(jìn)ADCC和補(bǔ)體活化作用的抗體的IFN-γ表達(dá)量下降，也可能提示了B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的輔助作用和對(duì)其他免疫細(xì)胞的活化作用減弱，表明感染雞細(xì)胞免疫和體液免疫機(jī)能發(fā)生障礙，是ARV感染導(dǎo)致免疫抑制的重要表現(xiàn)。CD8+T細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞，CTL)對(duì)清除病原起重要作用，細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的病原體被遞呈在感染細(xì)胞表面的MHC Ⅰ類(lèi)分子上，使感染細(xì)胞成為CTL的靶標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)SPF雞感染ARV后7 d和14 d，血液中CD8+T細(xì)胞含量升高，其中感染7 d與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，這可能是病毒大量感染機(jī)體后誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)增殖，清除被感染的細(xì)胞的結(jié)果，CD8+T細(xì)胞數(shù)量上的擴(kuò)增，也有可能提示抑制性T細(xì)胞群的活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)發(fā)生異常，這可能與ARV感染引起雞出現(xiàn)免疫抑制有關(guān)。ARV感染21 d后，感染組外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞含量與對(duì)照組相比，差異不顯著，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)感染日齡或病毒感染劑量有關(guān)；也有可能是ARV與感染雞相互作用導(dǎo)致體內(nèi)一系列綜合免疫反應(yīng)后的結(jié)果。

細(xì)胞因子在病毒的致病機(jī)制中具有重要作用。Kaiser P等[3]研究表明IL-18與馬立克病毒的免疫抑制相關(guān)；Brown C等[11]研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ與新城疫病毒的免疫抑制相關(guān)；在動(dòng)物病毒性傳染病中，如馬立克病毒、傳染性法氏囊病病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒、H5N1亞型AIV感染均可引起雛雞體內(nèi)TNF-α上調(diào)[12-13]；流感病毒研究表明，CD8+T細(xì)胞的出現(xiàn)與病毒的清除同步，其作用方式為直接裂解被感染細(xì)胞或釋放IFN-γ和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子，同時(shí)構(gòu)成了炎性細(xì)胞滲出的主要成分。本研究發(fā)現(xiàn)，在SPF雞感染ARV后1 d，外周血中具有抗病毒作用的IL-18、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)量均上調(diào)(IL-18和TNF-α，P<0.05)，而外周血CD8+T細(xì)胞含量則在14 d顯著增加(P<0.05)，表明在感染早期機(jī)體啟動(dòng)免疫保護(hù)程序，通過(guò)上調(diào)抗病毒因子表達(dá)水平，清除和控制病毒感染。細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)早于與CD8+T細(xì)胞含量上升，可能是由于基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成之間的時(shí)間滯后。炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6(除14 d)在ARV感染過(guò)程中持續(xù)表達(dá)上調(diào)，解釋了ARV感染引起組織器官的廣泛炎癥，如肝炎、心肌炎、胃腸炎、關(guān)節(jié)炎、肌腱炎等[1]。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)ARV感染可引起雞外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞含量的異常變化和細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-18、IFN-γ、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，說(shuō)明外周血T細(xì)胞亞型變化是ARV感染的重要特征之一，且上述6個(gè)細(xì)胞因子均參與了ARV的感染進(jìn)程，為ARV分子致病機(jī)制的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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Effects of Avian Reovirus Infection on Peripheral Blood T-cell Subtype Change and Cytokine Transcription in SPF Chickens

ZHANG Kun-li1,XIE Zhi-xun2,HUANG Li2,XIE Li-ji2,LIU Jia-bo2,DENG Xian-wen2,XIE Zhi-qin2,FAN Qing2,LUO Si-si2

(1.CollegeOfAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004,China; 2.GuangxiVeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandNewTechnology,Nanning,Guangxi,530001,China)

In order to explore the avian reovirus effect on the amount of CD4+, CD8+T cells and cytokine mRNA transcription levels of peripheral blood lymphocytes in SPF chickens, we examined the amount of peripheral blood CD4+, CD8+T cells by flow cytometry and determined mRNA expression levels of IL-1β,IL-6,IL-17,IL-18,IFN-γ and TNF-α by fluorescence quantitative PCR on 1, 7, 14, 21, 28 and 35 days in SPF chickens after infection with ARV. Our results showed that 7 d and 14 d post-infection, CD4+and CD8+T cell ratio in experiment group was higher than that in control group. Seven days post-infection, CD8+T cells were significantly increased(P<0.05); 1, 21, 28, 35 d post-infection, CD4+and CD8+T cell ratio in experiment group was lower than that in control group. One day post-infection, CD4+and CD8+ratio was significantly altered(P<0.05). Quantitative PCR results showed that, compared with the control group, the expression of IL-1β, IL-6 (except 7 d), IL-18 (except 14 d), TNF-α were up-regulated, whereas except 1 d, IL-17 and IFN-γ were down-regulated during the entire course of infection in peripheral blood lymphocytes.

Avian reovirus;cytokine;transcription level;flow cytometry;peripheral blood lymphocyte

2014-06-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160512)；廣西科技項(xiàng)目(桂科重1222003-2-4，2013GXNSFBA019120)；桂漁牧科項(xiàng)目(1304523)；廣西特聘專(zhuān)家專(zhuān)項(xiàng)(2011B020)

張昆麗(1988-)，女，云南玉溪人，碩士研究生，主要從事禽病防治與病原分子生物學(xué)研究。*

S852.659.4

:A

:1007-5038(2015)01-0001-04