韓蕓嬌, 邱雯雯, 查夢吟, 陳存社

（北京工商大學(xué)食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

費氏丙酸桿菌在酸奶加工中的應(yīng)用研究

韓蕓嬌, 邱雯雯, 查夢吟, 陳存社*

（北京工商大學(xué)食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

研究了費氏丙酸桿菌在酸奶發(fā)酵過程中和貯藏期的酸度、黏度、脫水收縮率以及后酸化等指標的變化情況。研究結(jié)果表明，由費氏丙酸桿菌發(fā)酵得到的發(fā)酵乳的發(fā)酵周期長，需24 h左右，黏度低，脫水收縮率高，口感欠佳，但共軛亞油酸質(zhì)量濃度較高，達到119.16 mg/L。將費氏丙酸桿菌發(fā)酵的酸奶在4℃下貯藏20 d后，酸度增加了約6°T，后酸化能力弱，有利于酸奶的貯藏；貯藏結(jié)束時，酸奶中共軛亞油酸（CLA）的質(zhì)量濃度為117.37 mg/L，仍然處于較高水平。發(fā)酵周期長和黏度低等缺點可能會限制費氏丙酸桿菌在酸奶發(fā)酵中的應(yīng)用。

丙酸桿菌；發(fā)酵酸奶；共軛亞油酸

目前，我國酸奶產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，市面上酸奶的種類琳瑯滿目，但應(yīng)用于酸奶發(fā)酵的益生菌種還僅僅局限于乳酸菌。酸奶產(chǎn)業(yè)需要長遠發(fā)展，所以開發(fā)新的益生菌已是形勢所需。

丙酸桿菌用于生產(chǎn)奶酪的研究已非常成熟，其代謝產(chǎn)生的丙酸、乙酸、琥珀酸等有機酸賦予奶酪獨特的風(fēng)味，但奶酪的風(fēng)味不符合我國消費者的口味習(xí)慣，所以奶酪沒有在我國獲得人們的追求和喜愛。除了應(yīng)用于生產(chǎn)奶酪以外，丙酸桿菌還可以用于發(fā)酵酸奶，但是國內(nèi)外利用丙酸桿菌發(fā)酵酸奶的研究還很少。丙酸桿菌屬于革蘭氏陽性菌，不運動，沒有芽孢形成，厭氧或耐氧，形態(tài)多樣，呈棒狀、球形或不規(guī)則的形狀［1］，在pH值接近于7，溫度為30～37℃的條件下生長最好。大部分丙酸桿菌在嚴格厭氧的條件下生長速度最快，當大量接種時，在暴露于空氣的液體培養(yǎng)基深部生長情況良好［1-2］。丙酸桿菌生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)要求較高，屬于化能異養(yǎng)型；維生素、泛酸、生物素是其生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。丙酸桿菌可以代謝的碳源范圍較廣，如葡糖糖、乳糖、果糖、纖維素、甘油、蛋白胨、乳酸等，代謝產(chǎn)物主要是丙酸、乙酸和CO2以及少量的甲酸、乳酸、琥珀酸等有機酸［3］。丙酸桿菌可以利用多種工業(yè)副產(chǎn)品作為能量來源，如玉米漿、蒸餾廢液、乳清、酪蛋白水解物，這為丙酸桿菌在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)［4］。本實驗擬對費氏丙酸桿菌在酸奶加工中的應(yīng)用進行研究，探討其在發(fā)酵酸奶過程中以及在貯藏期中各項理化指標的變化情況，總結(jié)費氏丙酸桿菌發(fā)酵酸奶的特點，并以此評價其用于酸奶加工中的可能性，旨在為酸奶生產(chǎn)提供一種新的益生菌，為后續(xù)丙酸桿菌應(yīng)用于乳品加工提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

直投式費氏丙酸桿菌發(fā)酵劑，實驗室自制；菌株CICC10019，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；

直投式乳酸菌發(fā)酵劑，發(fā)酵劑中包括保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌，安琪酵母股份有限公司；

伊利純牛奶；伊利原味酸奶（市售A）、蒙牛原味酸奶（市售B）；氯仿、鹽酸、無水硫酸鈉、共軛亞油酸（CLA）標品、甲醇、氫氧化鉀，均為分析純；正己烷，色譜純。

1.2 實驗儀器

LS-B35L-Ⅲ型立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；高速離心機，德國Eppendorf公司；Trace ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher公司；DV-Ⅲ型黏度計，美國Brookfield公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵過程中酸度的測定

將一份直投式費氏丙酸桿菌發(fā)酵劑接種于裝有50 mL滅菌牛奶的錐形瓶中，30℃發(fā)酵24 h。每隔2 h取樣，測定發(fā)酵乳的酸度，酸度的測定方法參照GB 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的測定》進行。每個時間點做3次平行實驗，繪制酸度隨時間變化的曲線圖。

1.3.2 發(fā)酵過程中黏度的測定

將一份直投式費氏丙酸桿菌發(fā)酵劑接種于裝有50 mL滅菌牛奶的錐形瓶中，30℃發(fā)酵24 h。每隔2 h取樣，測定發(fā)酵乳的黏度，每個時間點做3次平行實驗。

黏度的測定方法。黏度計Brookfield-DV-Ⅲ轉(zhuǎn)子（S63），轉(zhuǎn)速100 r/min，等待10 s后讀數(shù)，讀數(shù)間隔5 s，每個樣品記12個點，計平均值。

1.3.3 脫水收縮率的比較

取10.0 g發(fā)酵乳樣品，4℃、6 400 r/min，離心10 min，取上清液稱重［5］，樣品平行測3次，取平均值。并與兩種市售酸奶及乳酸菌發(fā)酵的酸奶進行比較。脫水收縮率計算公式，見式（1）。

1.3.4 發(fā)酵乳中CLA含量的測定

1.3.4.1 樣品預(yù)處理

脂肪酸的提取。取發(fā)酵乳2 mL于圓底離心管中，加入5 mL體積比為2∶1的氯仿-甲醇溶液，漩渦震蕩后靜置30 min，4℃條件下6 000 r/min離心10 min，用移液槍取出下層有機相置于螺口離心管中。

脂肪酸的甲酯化：脂肪酸甲酯化方法采用酸堿結(jié)合法，向脂肪酸提取步驟中得到的有機相中加入2 mL氫氧化鉀-甲醇（0.5 mol/mL）溶液，混合均勻，置于65℃水浴中反應(yīng)30 min，冷卻至室溫。再加入2 mL鹽酸-甲醇溶液（體積分數(shù)為10%），70℃水浴5 min。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入5 mL正己烷，震蕩后靜置，收集有機層，加入無水硫酸鈉除水，置于-20℃保存待檢測用。

1.3.4.2 氣相色譜檢測方法

氣相色譜檢測條件。DB5型色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序為初始溫度150℃，保持3 min，以4℃/min升至202℃，保持10 min，以2℃/min升至206℃，保持3 min，以1℃/min升至207℃，保持1 min，以2℃/min升至209℃，保持1 min；進樣口溫度250℃；載氣（He）流速1.0 mL/min；壓力2.4 kPa；進樣量1 μL；分流比20∶1；氫火焰離子化檢測器FID，燃氣為氫氣，助燃氣為空氣。

CLA標準曲線的繪制。稱取CLA標準品溶解于甲醇中，按照1.3.4.1的方法進行甲酯化。將CLA甲酯用色譜純正己烷稀釋到不同濃度（0.045～0.360 g/L）。按GC檢測條件測定不同濃度標準溶液的峰面積。以CLA濃度為縱坐標，峰面積為橫坐標，繪制CLA標準曲線、得出標準方程，根據(jù)標準方程可以求出未知樣品的CLA的濃度。

1.3.4.3 發(fā)酵乳中CLA含量的測定

將直投式費氏丙酸桿菌發(fā)酵劑接種于50 mL滅菌乳中，30℃發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束后按1.3.4.1中的方法對發(fā)酵乳進行預(yù)處理，使用氣相色譜進行檢測，3次平行。

1.3.5 貯藏期中pH值與酸度的測定

將直投式費氏丙酸桿菌發(fā)酵劑接種于50 mL滅菌乳中，30℃發(fā)酵24 h后，放入4℃冰箱中冷藏。測定發(fā)酵乳在冷藏0，5，10，15，20 d的酸度與pH值，每組做3次平行實驗。

1.3.6 貯藏期中CLA的測定

將一份直投式費氏丙酸桿菌發(fā)酵劑接種于50 mL滅菌乳中，30℃發(fā)酵24 h后，放入4℃冰箱中冷藏。測定發(fā)酵乳在冷藏0，5，10，15，20 d的CLA含量，每組做3次平行實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中酸度的變化

費氏丙酸桿菌單獨發(fā)酵酸奶過程中酸度隨發(fā)酵時間的變化曲線如圖1。從圖1中可以看出，酸度隨著時間增加而不斷增大。酸度變化的趨勢與費氏丙酸桿菌的生長規(guī)律有關(guān)，在發(fā)酵初期，費氏丙酸桿菌生長緩慢，產(chǎn)酸速率小，酸度增加緩慢；發(fā)酵到6 h以后，費氏丙酸桿菌的生長開始進入對數(shù)期，產(chǎn)酸速率加快，酸度的增加也明顯變快，到發(fā)酵結(jié)束時，酸度達到72.0°T。

圖1 費氏丙酸桿菌單獨發(fā)酵酸奶過程中酸度的變化Fig.1 Changes of acidity of propionibacterium freudenreichii fermented yogurt process

一般來說，成品酸奶的酸度需要達到70～110°T，從圖1結(jié)果中可以看出，費氏丙酸桿菌發(fā)酵酸奶需要發(fā)酵24 h才能達到酸度的最低要求，這是由費氏丙酸桿菌的生長代謝周期長導(dǎo)致的。在工業(yè)生產(chǎn)中，乳酸菌發(fā)酵酸奶僅需6 h左右，而費氏丙酸桿菌發(fā)酵酸奶的周期則遠遠長于乳酸菌，這在很大程度上會限制費氏丙酸桿菌在酸奶發(fā)酵中的應(yīng)用。

2.2 發(fā)酵過程中黏度的變化

在酸奶發(fā)酵的過程中，由于乳酸菌產(chǎn)生的一些胞外多糖以及牛奶體系中pH值的降低，會導(dǎo)致牛奶的黏度逐漸增大，從而賦予酸奶黏稠醇厚的口感［6］。利用費氏丙酸桿菌發(fā)酵酸奶，每隔2 h測定發(fā)酵乳黏度，黏度隨時間變化的曲線如圖2。從圖2中可以看出，隨著時間的增加，黏度呈現(xiàn)出先增大，然后保持不變，最后逐漸下降的趨勢。費氏丙酸桿菌發(fā)酵酸奶的黏度很低，在最高時只有780.95 cp，這可能是由于費氏丙酸桿菌生長周期長，代謝緩慢，在短時間內(nèi)不能產(chǎn)生足夠的胞外多糖，所以導(dǎo)致發(fā)酵乳的黏度較低；另一方面，費氏丙酸桿菌發(fā)酵的酸奶在發(fā)酵結(jié)束時的酸度也會影響酸奶凝膠體系的形成。在發(fā)酵后期，黏度出現(xiàn)了下降的趨勢，可能是因為費氏丙酸桿菌在代謝過程中產(chǎn)生了水以及乳清析出，導(dǎo)致黏度下降。黏度是影響酸奶口感的一個重要因素，費氏丙酸桿菌發(fā)酵的酸奶的黏度較低，這可能會導(dǎo)致酸奶的口感欠佳。

2.3 脫水收縮率的比較

脫水收縮率也是反映酸奶品質(zhì)的一個重要指標，實驗測定并對比了費氏丙酸桿菌與乳酸菌發(fā)酵的酸奶以及兩種市售酸奶的脫水收縮率，結(jié)果如圖3。

圖2 費氏丙酸桿菌單獨發(fā)酵酸奶過程中黏度的變化Fig.2 Changes of viscosity of propionibacterium freudenreichii fermented yogurt

圖3 脫水收縮率的比較Fig.3 Comparison of syneresis rate

從圖3中可以看出，費氏丙酸桿菌發(fā)酵酸奶的脫水收縮率最高，其次是乳酸菌，兩種市售酸奶的脫水收縮率較低。酸奶是一個凝膠體系，脫水收縮率的大小可以體現(xiàn)酸奶的穩(wěn)定性，脫水收縮率小，說明酸奶凝膠體系穩(wěn)定，持水性好，乳清不易析出。費氏丙酸桿菌發(fā)酵酸奶的脫水收縮率高，可能是由其產(chǎn)生的胞外多糖少導(dǎo)致的。胞外多糖具有乳化和增加黏度的作用，可以提高酸奶的持水性和穩(wěn)定性，改善酸奶的質(zhì)地和口感。在實驗過程中也發(fā)現(xiàn)，費氏丙酸桿菌發(fā)酵的酸奶容易出現(xiàn)乳清析出的現(xiàn)象。此外，市售酸奶中會添加一些穩(wěn)定劑和增稠劑，這也在一定程度上降低了脫水收縮率。

2.4 發(fā)酵乳中CLA含量的測定

圖4為CLA的標準曲線圖，對不同質(zhì)量濃度的CLA標準品進行氣相色譜檢測，得出對應(yīng)的峰面積，做質(zhì)量濃度-峰面積的標準曲線圖。線性回歸方程為：y=0.121 7x+1.393 3，R2=0.999 1，說明在45～360 mg/L質(zhì)量濃度時，濃度與峰面積線性關(guān)系良好，可以根據(jù)峰面積求出樣品中CLA的質(zhì)量濃度。

圖4 CLA標準曲線Fig.4 Standard curve of CLA

圖5是CLA標品的氣相色譜圖，標品在保留時間為20.74 min和21.01 min處出現(xiàn)一個雙峰。

圖5 CLA標品的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of CLA

利用氣相色譜法檢測發(fā)酵好的酸奶中CLA的含量，發(fā)酵乳的氣相色譜圖見圖6。發(fā)酵乳在保留時間為20.74 min和21.79 min處出現(xiàn)一個雙峰，與標品的出峰時間基本一致，并在質(zhì)譜庫中比對確認是CLA。根據(jù)峰面積，利用標準曲線求得費氏丙酸桿菌發(fā)酵的酸奶中CLA的含量達到119.16 mg/L，處于一個較高的水平。

2.5 發(fā)酵乳在貯藏期中酸度的變化

4℃條件下貯藏期間酸度的變化如圖7。從圖7中可以看出，在貯藏期中酸度增加的幅度不大。在貯藏期前10 d酸度快速增加；貯藏10 d以后，酸度增加緩慢，到貯藏末期，酸度基本保持不變。

圖6 發(fā)酵乳的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of propionibacterium freudenreichii fermented yogurt

圖7 發(fā)酵乳在貯藏期中酸度的變化Fig.7 Changes of acidity during storage period

優(yōu)良的發(fā)酵菌株需要具備后酸化能力弱的特點，如果酸奶的后酸化現(xiàn)象嚴重，貯藏期中酸度大幅增加，會使酸奶的品質(zhì)大大下降。一般要求在冷藏條件下貯藏3周后，酸度增加的幅度在7.5～10.0°T［7］，從圖7中可以看出，費氏丙酸桿菌發(fā)酵的酸奶在4℃下貯藏20 d之后，酸度從70.1°T增加到76.0°T，增加了約6°T，說明費氏丙酸桿菌的后酸化能力弱，于酸奶的貯藏有利。

2.6 發(fā)酵乳在貯藏期中CLA含量的變化

圖8 發(fā)酵乳在貯藏期中CLA含量的變化Fig.8 Changes of CLA concent during storage period

于4℃條件下冷藏期間發(fā)酵乳CLA含量的變化如圖8。從圖8中可以看出，CLA含量在整個貯藏期中呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。在貯藏期的0～10 d，CLA含量緩慢增加，可能是因為，在貯藏初期，費氏丙酸桿菌生長代謝緩慢，使CLA含量有小幅度上升；當貯藏天數(shù)達到10 d以后，CLA含量開始減少，這是由于到貯藏后期菌體的生長代謝趨于停止，活菌數(shù)也開始減少，CLA不再積累，同時，由于CLA（共軛亞油酸）不穩(wěn)定，會被氧化生成其他飽和的脂肪酸，最終導(dǎo)致含量逐漸減少。在貯藏結(jié)束時，酸奶中CLA的含量為117.37 mg/L，仍然處于一個較高的水平。

3 結(jié) 論

實驗表明，費氏丙酸桿菌發(fā)酵酸奶的特點：1）發(fā)酵周期長，需要發(fā)酵24 h左右；2）發(fā)酵的酸奶黏度低，脫水收縮率高，使酸奶的口感欠佳；3）發(fā)酵的酸奶中含有CLA，質(zhì)量濃度為119.16 mg/L，處于一個較高的水平，并且在貯藏過程中CLA不會有很大的損失，通過初步感官評價，發(fā)現(xiàn)費氏丙酸桿菌發(fā)酵的酸奶在風(fēng)味方面與傳統(tǒng)酸奶有較大差別，需要進一步分析；4）費氏丙酸桿菌的后酸化能力弱，有利于酸奶的貯藏。費氏丙酸桿菌酸奶的發(fā)酵周期長，黏度低，脫水收縮率高等特點可能會限制費氏丙酸桿菌在酸奶發(fā)酵中的應(yīng)用。

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Study on Application of Propionibacterium Freudenreichii in Yogurt Processing

HAN Yunjiao， QIU Wenwen， ZHA Mengyin， CHEN Cunshe*
（Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

Changes of acidity，viscosity，syneresis rate，and after-acid capacity of Propionibacterium freudenreichii fermented yogurt during the fermentation and the storage period were researched in this study.The results showed that the fermentation period was about 24 h and the yogurt had the lower viscosity，higher syneresis rate，and higher conjugated linoleic acid（CLA）content（119.16 mg/L）.After stored at 4℃for 20 days，the acidity of yogurt increased about 6°T and the weak after-acid capacity of yogurt was benefit to the storage of yogurt.After storage，the CLA content of yogurt was about 117.37 mg/L.However，the long fermentation period and low viscosity might be the limits of application of Propionibacterium freudenreichii in yogurt.

Propionibacterium freudenreichii；yogurt fermentation；conjugated linoleic acid

葉紅波）

TS201.3；TS252.54

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.05.008

2095-6002（2015）05-0047-05

韓蕓嬌，邱雯雯，查夢吟，等.費氏丙酸桿菌在酸奶加工中的應(yīng)用研究［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2015，33（5）：47-51.

HAN Yunjiao，QIU Wenwen，ZHA Mengyin，et al.Study on application of Propionibacterium Freudenreichii in yogurt processing［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（5）：47-51.

2014-12-03

北京市教委科技發(fā)展計劃項目（KZ20110011013）；北京市自然科學(xué)基金資助項目。作者簡介：韓蕓嬌，女，碩士研究生，研究方向為食品微生物；*陳存社，男，教授，博士，主要從事食品微生物發(fā)酵等方面的研究。通信作者。