柳楊

米非司酮在抑制卵巢癌細胞紫杉醇耐藥產(chǎn)生的作用

柳楊

目的探討米非司酮在抑制卵巢癌細胞株skov3、A2780對紫杉醇耐藥產(chǎn)生的作用。方法在紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細胞株skov3、A2780的過程中,使用不同濃度米非司酮,應(yīng)用免疫組化方法比較受不同濃度米非司酮作用的各組細胞株的P糖蛋白(p-glyco-protein,P-gp)的表達,同時檢測各細胞的生長曲線。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測各組細胞的半數(shù)致死濃度(IC50)；采用羅丹明123(Rh123)為熒光探針,使用流式細胞儀比較各株細胞的胞內(nèi)Rh123含量。結(jié)果紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌耐藥的過程中使用米非司酮,誘導(dǎo)后卵巢癌細胞株skov3、A2780中P-gp含量有所下降。結(jié)論米非司酮可抑制卵巢癌細胞紫杉醇耐藥的產(chǎn)生。

米非司酮；卵巢癌；skov3；A2780；耐藥

卵巢癌是婦科的常見惡性腫瘤之一,紫杉醇是治療卵巢癌的一線用藥[1]。臨床上化療耐藥是導(dǎo)致卵巢癌化療失敗的主要原因[2]。本文模擬卵巢癌細胞產(chǎn)生紫杉醇耐藥的過程,使用米非司酮為耐藥逆轉(zhuǎn)劑,探討米非司酮在抑制卵巢癌細胞紫杉醇耐藥產(chǎn)生的作用。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人卵巢癌細胞株skov3購于上海研晶生物科技有限公司,A2780購于上海拜力生物科技有限公司,兩株細胞分別置于培養(yǎng)基含10％小牛血清的RPMI-1640、DMEM,并放于相對濕度90％、37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥品 DMEM和RPMI-1640均購于Gibco公司,紫杉醇(Taxol)購于美國百時美施貴寶公司,SP免疫組化試劑盒購于北京北瑞達醫(yī)藥科技有限公司,羅丹明(Rohdamin123,Rh123)購于Sigma公司,鼠抗人MDR1單克隆抗體購于上海億欣生物科技有限公司,米非司酮由浙江仙琚制藥股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Taxol誘導(dǎo)skov3 陽性對照組：取處于對數(shù)生長期skov3細胞,置于含有Taxol1.5 μmol/ml的10％小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中作用1 h,然后使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,之后使用不含紫杉醇的10％小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液養(yǎng)至skov3細胞的生長恢復(fù)對數(shù)生長。實驗組：共三組,skov3細胞分別置于含紫杉醇1.5 μmol/ml的10％小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液內(nèi),再分別加入1、2.5、10 μm米非司酮,作用1 h,各組均行30次誘導(dǎo)。陰性對照組：skov3直接傳代,不加紫杉醇。

1.3.2 Taxol誘導(dǎo)A2780 處理方法同skov3 細胞,但紫杉醇濃度為0.2 μmol/ml,培養(yǎng)液為10％小牛血清DMEM培養(yǎng)液。

1.3.3 細胞形態(tài)的觀察及生長曲線的繪制 取對數(shù)生長期的各組細胞接種在24孔板上,5000個/孔,置于37℃、相對濕度90％及含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞貼壁生長后,每天同一時間取其中3孔細胞行細胞計數(shù),連續(xù)觀察8 d,繪制各組的細胞生長曲線。

1.3.4 SP染色 使用3％H2O2孵育細胞爬片10 min,封閉后分別加入鼠抗人MDR1單抗(1：50),DAB顯色、復(fù)染、脫水、封片,觀察P-gp表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞經(jīng)誘導(dǎo)后的形態(tài)

2.1.1 skov3細胞 陰性對照組：細胞均貼壁生長,光鏡下細胞邊界清晰,呈梭形上皮樣生長,折光性好。陽性對照組：大部分細胞壞死或凋亡,存活細胞大小不一,形態(tài)不規(guī)則,邊界模糊。誘導(dǎo)過程中細胞形態(tài)改變,突起增多,胞質(zhì)有空泡,細胞畸形。實驗組：三組實驗組細胞均出現(xiàn)陽性對照組所見細胞特點,且米非司酮濃度越高,細胞壞死越嚴重。

2.1.2 A2780細胞 陰性對照組：細胞生長良好,形態(tài)較規(guī)則,透亮度高。陽性對照組：細胞體積變小,細胞呈團簇生長。實驗組：細胞呈陽性對照組樣特點,且米非司酮藥物濃度越高,細胞壞死越嚴重。

2.2 各組細胞生長曲線 經(jīng)Taxol誘導(dǎo)后,兩株細胞的亞克隆篩選趨向于細胞生長周期較長或增殖不旺盛的細胞亞群。當(dāng)加入米非司酮后該傾向性更明顯,且米非司酮藥物濃度越高,細胞亞克隆生長越不旺盛。見圖1,圖2。

圖1 Taxol作用skov3后各組細胞生長曲線

圖2 Taxol作用A2780后各組細胞生長曲線

2.3 經(jīng)Taxol作用24 h后半數(shù)致死濃度(IC50) 經(jīng)Taxol誘導(dǎo)30次后,兩株細胞耐藥性顯著提高,與原代細胞相比,IC50明顯提高(P＜0.05),提示細胞株經(jīng)Taxol誘導(dǎo)后耐藥性明顯提高。使用米非司酮的各實驗組與陽性對照組相比,耐藥性顯著下降(P＜0.05),且呈米非司酮濃度越高,耐藥性下降越明顯的趨勢,見表1。

表1 各組細胞經(jīng)紫杉醇作用24 h后的IC50(±s)

表1 各組細胞經(jīng)紫杉醇作用24 h后的IC50(±s)

注：與陰性對照組比較,aP＜0.05；與陽性對照組比較,bP＜0.05

細胞株 組別 IC50(μmol/ml) skov3細胞株 陰性對照組 0.019±0.003陽性對照組 0.523±0.025a紫杉醇+1 μm米非司酮 0.426±0.021b紫杉醇+2.5 μm米非司酮 0.228±0.012b紫杉醇+10 μm米非司酮 0.150±0.009bA2780細胞株 陰性對照組 0.063±0.003陽性對照組 0.130±0.007a紫杉醇+1 μm米非司酮 0.114±0.005b紫杉醇+2.5 μm米非司酮 0.095±0.005b紫杉醇+10 μm米非司酮 0.084±0.004b

2.4 流式細胞儀檢測熒光強度 經(jīng)Taxol誘導(dǎo)后的細胞,熒光強度顯著低于無誘導(dǎo)時(P＜0.01),使用不同濃度的米非司酮后,各實驗組的熒光強度較僅使用Taxol的陽性對照組顯著提高(P＜0.05),見表2,提示不同濃度的米非司酮可不同程度地增加羅丹明在兩株細胞中的蓄積。2.5 免疫組化SP染色結(jié)果 P-gp在兩株原代細胞中未見表達,而使用不同濃度米非司酮后的各組細胞均呈陽性表達,而單用Taxol誘導(dǎo)的兩株細胞,呈強陽性表達。

表2 各組細胞熒光強度的比較(±s)

表2 各組細胞熒光強度的比較(±s)

注：與陰性對照組比較,aP＜0.01；與陽性對照組比較,bP＜0.05

細胞株 組別 熒光強度skov3細胞株 陰性對照組 94.1±3.0陽性對照組 18.6±2.7a紫杉醇+1 μm米非司酮 34.6±4.1b紫杉醇+2.5 μm米非司酮 64.5±4.3b紫杉醇+10 μm米非司酮 79.1±2.2bA2780細胞株 陰性對照組 98.5±1.4陽性對照組 46.5±2.2a紫杉醇+1 μm米非司酮 55.0±2.6b紫杉醇+2.5 μm米非司酮 73.1±3.3b紫杉醇+10 μm米非司酮 81.3±1.9b

3 討論

目前,MDR基因及其表達物P糖蛋白介導(dǎo)多重耐藥是腫瘤細胞耐藥研究的熱點,MDR基因的表達與腫瘤細胞對化療藥物耐藥相關(guān)[3]。近年來有研究發(fā)現(xiàn),米非司酮可逆轉(zhuǎn)P糖蛋白介導(dǎo)的耐藥[4]。目前發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞多重耐藥的產(chǎn)生與MDR1基因擴增和由其所致P-gp產(chǎn)生并增多相關(guān)[5]。米非司酮是一種作用于受體水平的孕激素拮抗劑[6],近年來研究表明,米非司酮對紫杉醇耐藥的卵巢癌具有耐藥逆轉(zhuǎn)作用。

本文通過在使用紫杉醇誘導(dǎo)skov3、A2780細胞株產(chǎn)生耐藥的過程中,使用米非司酮干預(yù),觀察各組細胞的生長曲線、IC50,并以Rh123為熒光探針比較各細胞內(nèi)Rh123含量,探討米非司酮抑制紫杉醇耐藥性的產(chǎn)生。實驗結(jié)果表明,經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)后,兩株細胞形態(tài)有所改變,使用米非司酮的細胞也出現(xiàn)類似變化,但加入高濃度米非司酮者細胞壞死明顯,篩選出的亞克隆生長不旺盛,且使用米非司酮濃度越高,細胞的IC50越低,以上結(jié)果均表明米非司酮可保持卵巢癌細胞對紫杉醇的敏感性。另外,采用流式細胞儀檢測P-gp,米非司酮干預(yù)的細胞株中,Rh123熒光強度明顯強于僅使用紫杉醇誘導(dǎo)的細胞株,表明米非司酮可增加Rh123在細胞內(nèi)的蓄積,且米非司酮濃度越高,蓄積越多。提示米非司酮逆轉(zhuǎn)耐藥性可能與降低細胞非特異性外排相關(guān)。

綜上所述,米非司酮對人卵巢癌細胞對紫杉醇耐藥具有一定的逆轉(zhuǎn)作用,且藥物濃度越高,逆轉(zhuǎn)作用越明顯,對治療卵巢癌具有重要價值。

[1]楊雙,王曉暉,林曉華. 紫杉醇聯(lián)合順鉑不同給藥途徑對完全卵巢癌療效的影響.廣東醫(yī)學(xué),2010,31(5):646-647.

[2]任立新,王亞帝.紫杉醇聯(lián)合洛鉑或順鉑治療晚期老年卵巢癌的療效和安全性.中國老年學(xué)雜志,2013,33(10):2284-2286.

[3]謝紅旗,徐顯輝,柯明耀,等.多藥耐藥相關(guān)蛋白基因在肺癌組織中的表達及意義.實用癌癥雜志,2010,25(2):152.

[4]Zhang H,Wang J,Cai K,et al. Downregulation of gene MDR1 by shRNA to reverse multidrug-resistance of ovarian cancer A2780 cells. Cancer Res Ther,2012,8(2):226-231.

[5]Januchowski R,Wojtowicz K,Sujka-Kordowska P,et al. MDR gene expression analysis of six drug-resistant ovarian cancer cell lines. Biomed Res Int,2013:241763.

[6]王超,譚文華.米非司酮在耐藥性卵巢癌治療中的研究.醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(24):4215-4217.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.03.188

2014-10-29]

471000 鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院