石文兵，戚景南，賀 薇，萬邦江

（1.無機(jī)特種功能材料重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 408100；2.唐山科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院，唐山 063001）

半胱氨酸抑制二氧化鈰納米顆粒化學(xué)發(fā)光

石文兵1，戚景南2，賀 薇1，萬邦江1

（1.無機(jī)特種功能材料重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 408100；2.唐山科技職業(yè)技術(shù)學(xué)院，唐山 063001）

在堿性條件下，二氧化鈰納米顆粒能夠有效催化過氧化氫-魯米諾體系的化學(xué)發(fā)光。然而，當(dāng)加入半胱氨酸，該體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度得到極大抑制。該文詳細(xì)討論發(fā)光條件，如二氧化鈰納米顆粒、過氧化氫、魯米諾等質(zhì)量濃度及魯米諾pH對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。在最佳試驗(yàn)條件下，探討半胱氨酸的抑制特性，在一定范圍內(nèi)抑制強(qiáng)度與半胱氨酸的質(zhì)量濃度成正比。線性范圍為0.01～1.8μg/mL，（r=0.994 6），檢出限（3σ）為1.6ng/mL，對(duì)質(zhì)量濃度為1.0μg/mL的半胱氨酸進(jìn)行11次平行測定，RSD為0.72%。該法有望用于測定實(shí)際樣品中半胱氨酸的含量。

半光氨酸；抑制；二氧化鈰納米顆粒；化學(xué)發(fā)光

0 引 言

L-半胱氨酸屬于蛋白質(zhì)氨基酸，在臨床醫(yī)學(xué)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。L-半胱氨酸參與多種重要的細(xì)胞功能，如蛋白質(zhì)合成、解毒和新陳代謝等；因此，靈敏、快速和廉價(jià)檢測半胱氨酸的含量具有重要意義。近幾年，越來越多的方法已用于測定藥物、尿液、血清和血漿中L-半胱氨酸含量，如高效液相色譜法（HPLC）[1-2]、分光光度法[3-4]、固相微萃取[5]、比色法[6-7]、電化學(xué)法[8]、熒光法[9]。 雖然這些方法大多數(shù)具有靈敏度高和選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，但它們要么儀器昂貴，要么步驟繁復(fù)耗時(shí)?；瘜W(xué)發(fā)光法（LC）因其靈敏度高、線性范圍寬、儀器設(shè)備便宜簡單、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域。由于傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光強(qiáng)度較弱，因此利用一些新興材料來提高化學(xué)發(fā)光法的靈敏度是近年來的研究熱點(diǎn)。

功能納米材料在化學(xué)催化、分子識(shí)別、生化標(biāo)記等領(lǐng)域具有誘人的應(yīng)用前景[10-11]，但多數(shù)納米粒子的水溶性不好，傳統(tǒng)的發(fā)光體系研究都集中在分子水平。近年來，納米粒子催化液相化學(xué)發(fā)光得到了蓬勃發(fā)展[12-13]。然而，制備具有水溶性好、催化效率高的納米材料仍是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難題。本文合成了一種水溶性好、化學(xué)發(fā)光催化效率高的二氧化鈰納米顆粒，并根據(jù)半胱氨酸能夠有效抑制二氧化鈰納米顆粒-H2O2-魯米諾發(fā)光體系，詳細(xì)研究了各種發(fā)光條件，得出了體系對(duì)半胱氨酸的響應(yīng)特性，該體系有望用于半胱氨酸的實(shí)際樣品分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

發(fā)光信號(hào)用RFL-1型超微弱化學(xué)發(fā)光/生物發(fā)光檢測儀（西安瑞邁電子科技有限公司）檢測；利用蠕動(dòng)泵（15r/min，30 r/min，上海儀表電機(jī)廠）泵送溶液；流動(dòng)注射系統(tǒng)各部件利用聚四氟乙烯管（內(nèi)徑0.8 mm）連接；二氧化鈰納米顆粒的濃度利用TPS-7000型ICP單道掃描光譜儀（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）測定；二氧化鈰納米顆粒的紅外光譜用Tensor27型紅外光譜儀（BRUKER公司，德國）測定；85-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）用于合成二氧化鈰納米顆粒時(shí)磁力攪拌；800型離心沉淀器（上海手術(shù)機(jī)械廠）用于離心二氧化鈰納米顆粒。

魯米諾儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取1.772 g魯米諾，用1.0 mmol/L NaOH溶解并定容至 1 000 mL，即得0.01 mol/L儲(chǔ)備液，需用時(shí)取適量用0.8 mol/L碳酸鈉溶液稀釋至所需濃度；過氧化氫溶液：用水稀釋30%過氧化氫（重慶東方試劑廠）至所需濃度；二氧化鈰納米顆粒（CeO2NPs）：其合成和表征參照前期工作[14]，需用時(shí)用水稀釋2.633 g/L二氧化鈰納米顆粒儲(chǔ)備液至所需濃度；六水硝酸鈰購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃氨水（30%）購自重慶川東化工集團(tuán)有限公司試劑廠；聚丙烯酸（PAA）購自上海晶純?cè)噭┯邢薰?；半胱氨酸購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

化學(xué)發(fā)光的測定：如圖1所示，超純水作為載流將半胱氨酸帶入三通（T）點(diǎn)與魯米諾-H2O2-二氧化鈰納米顆粒溶液匯合，混合后進(jìn)入反應(yīng)盤管進(jìn)而抑制化學(xué)發(fā)光，實(shí)驗(yàn)參數(shù)由IFFM-D型流動(dòng)注射分析儀設(shè)定。

圖1 半胱氨酸抑制化學(xué)發(fā)光流動(dòng)注射示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 二氧化鈰納米顆粒對(duì)制備與表征

二氧化鈰納米顆粒的合成和表征參照前期工作完成[14]，由于其粒徑極小，反襯度不高，不適合利用TEM來表征，動(dòng)態(tài)光散射的表征結(jié)果見圖2，二氧化鈰納米顆粒的水合粒子半徑為2.6～4.2nm。

圖2 二氧化鈰納米顆粒的動(dòng)態(tài)光散射圖

2.2 二氧化鈰納米顆粒對(duì)發(fā)光體系的增敏作用

為證明納米顆粒對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，考察了加入CeO2NPs前后H2O2-魯米諾發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度變化情況，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，當(dāng)有CeO2NPs存在時(shí)，H2O2-魯米諾體系的發(fā)光強(qiáng)度得到極大增強(qiáng)（見圖3中的1）。為驗(yàn)證該增敏效果非游離的Ce3+所致，用0.5mol/L的鹽酸將CeO2NPs沉淀下來，于15000r/min轉(zhuǎn)速離心后，用Na2CO3將離心液調(diào)至中性，再將其作為催化劑，于相同的實(shí)驗(yàn)條件（與未處理的CeO2NPs溶液相同）下測定其催化效果。試驗(yàn)結(jié)果表明（見圖3中的2），濾液的催化效果與CeO2NPs相比，其增強(qiáng)的發(fā)光信號(hào)可忽略不記，說明催化效果來源于CeO2NPs。

圖3 二氧化鈰納米顆粒對(duì)H2O2-魯米諾發(fā)光體系的影響

2.3 半胱氨酸對(duì)發(fā)光體系的抑制作用

為考察半胱氨酸對(duì)該發(fā)光體系的影響，選擇3個(gè)半胱氨酸質(zhì)量濃度0.1，1.0，10μg/mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見圖4），半胱氨酸能夠有效抑制該發(fā)光體系，而且隨著半胱氨酸質(zhì)量濃度的增高，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)半胱氨酸質(zhì)量濃度降低到0.1 μg/mL時(shí)，仍有顯著的抑制效果，這使得該法在檢測半胱氨酸是可獲得較高的靈敏度。

2.4 其他發(fā)光條件對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響

魯米諾與過氧化氫的質(zhì)量濃度、二氧化鈰納米顆粒和魯米諾中的pH對(duì)該體系的影響尤為顯著，詳細(xì)考察了這些條件對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。在魯米諾為1.0×10-6～5.0×10-4mol/L范圍內(nèi)，發(fā)光強(qiáng)度隨其物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)達(dá)到1.0×10-5mol/L時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度驟降，故選擇魯米諾的最佳物質(zhì)量濃度為1.0× 10-5mol/L。當(dāng)H2O2物質(zhì)量濃度小于1.0×10-4mol/L時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度隨其升高而升高，然而當(dāng)H2O2物質(zhì)量濃度超過該值時(shí)化學(xué)發(fā)光信號(hào)反而降低，故本實(shí)驗(yàn)選擇H2O2最佳物質(zhì)量濃度為1.0×10-4mol/L。二氧化鈰納米顆粒為本實(shí)驗(yàn)的催化劑，其用量直接影響著發(fā)光強(qiáng)度?？疾炝?.3～1316.5μg/mL范圍內(nèi)二氧化鈰納米顆粒對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)其質(zhì)量濃度為132μg/mL時(shí)發(fā)光信號(hào)達(dá)最大值，故本實(shí)驗(yàn)選擇該值為最佳質(zhì)量濃度?？疾祠斆字Z溶液中的pH對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響，包括氫氧化鈉、碳酸鈉及碳酸氫鈉緩沖溶液以及單獨(dú)的碳酸鈉對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)的碳酸鈉溶液更有利于該體系的發(fā)光，而且當(dāng)碳酸鈉為1.0mol/L（pH 11.73）時(shí)體系的發(fā)光強(qiáng)度最強(qiáng)。其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度也具有一定的影響，如流量太小峰型很寬，影響測試效率，太大則發(fā)光信號(hào)會(huì)降低，當(dāng)流速為3.6mL/min時(shí)，既有較好的信號(hào)強(qiáng)度又有較快的分析速度，故選擇3.6mL/min作為最佳流量。溫度發(fā)光信號(hào)也有一定的影響，溫度越高發(fā)光強(qiáng)度越高，但是在室溫（25℃）時(shí)，發(fā)光信號(hào)就達(dá)到分析要求，為了簡化操作程序，選擇室溫為分析溫度。另外，進(jìn)樣體積為150μL，混合管與三通管之間的管長為7.5cm，負(fù)高壓為-650V，增益為×2時(shí)，體系具有最佳的信號(hào)輕度。

圖4 半胱氨酸對(duì)二氧化鈰納米顆粒-過氧化氫-魯米諾發(fā)光體系的影響 （1.0×10-5mol/L魯米諾；1.0×10-4mol/LH2O2）

2.5 發(fā)光體系對(duì)半胱氨酸的響應(yīng)特性

在上述優(yōu)化試驗(yàn)條件下，在0.01～1.8μg/mL范圍內(nèi)半胱氨酸質(zhì)量濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，lgΔI=0.532 97lgc+3.779 23（r=0.9946）（n=9）（ΔI為化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，c為半胱氨酸質(zhì)量濃度（μg/mL），r為相關(guān)系數(shù)）。根據(jù)IUPAC的建議算出的檢出限（3σ）為1.6 ng/mL，對(duì)1.0 μg/mL的半胱氨酸平行測定11次，得RSD為0.72%。

2.6 化學(xué)發(fā)光機(jī)理探討

圖5 化學(xué)發(fā)光體系的紫外吸收光譜

為探討二氧化鈰納米顆粒對(duì)魯米諾-H2O2體系增強(qiáng)作用的反應(yīng)機(jī)理，采用紫外-可見吸收光譜進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，魯米諾-H2O2體系在298，358nm處有兩個(gè)吸收峰（圖5曲線4）；發(fā)現(xiàn)二氧化鈰納米顆粒在299nm處有1個(gè)吸收峰（圖5曲線1）；二氧化鈰納米顆粒-魯米諾-H2O2體系在298，358nm處有2個(gè)特征吸收峰，二氧化鈰納米顆粒的特征吸收峰消失是因?yàn)槠湮辗逶?98nm處與魯米諾-H2O2體系的吸收峰重疊，故它們的吸收峰位置并沒有改變（圖5曲線2），也沒有新峰生成，說明將二氧化鈰納米顆粒加入魯米諾-H2O2體系后，沒有生成新的物質(zhì)，可以推斷二氧化鈰納米顆粒在魯米諾-H2O2體系中僅起到催化作用。半胱氨酸的吸收（圖5曲線5）可以忽略不計(jì)，但將半胱氨酸加入二氧化鈰納米顆粒-魯米諾-H2O2體系后，在298，358nm的吸收峰明顯降低（圖5曲線3），說明半胱氨酸明顯抑制了二氧化鈰納米顆粒催化魯米諾-H2O2體系產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，從而起到抑制發(fā)光的作用。

3 結(jié)束語

本文采用二氧化鈰納米顆粒作為催化劑催化H2O2-魯米諾發(fā)光體系可獲得很強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。當(dāng)加入半胱氨酸后該發(fā)光體系的發(fā)光強(qiáng)度得到極大抑制?；诖耍覀儍?yōu)化了各種發(fā)光條件，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，根據(jù)抑制的發(fā)光強(qiáng)度與半胱氨酸濃度呈良好的線性關(guān)系構(gòu)建了測定半胱氨酸的方法。

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The chemiluminescence inhibition of cysteine on ceria nanoparticles

SHI Wenbing1，QI Jingnan2，HE Wei1，WAN Bangjiang1
（1.Chongqing Key Laboratory of Inorganic Special Functional Materials，College of Chemistry and Chemical Engineering，Yangtze Normal University，Chongqing 408100，China；2.Tangshan Vocational College of Science and Technology，Tangshan 063001，China）

In basic conditions，the luminol-H2O2chemiluminescence system can be effectively catalyzed by ceria nanoparticles，however，the chemiluminescence intensity wastremendously inhibited when the cysteine was added into this system.In this paper，the effects of the chemiluminescence conditions such as ceria nanoparticles concentration，luminuol concentration，H2O2concentration and the pH in luminol solution were investigated in detail.Under optimal conditions，the inhibition properties of cysteine have been investigated，in certain concentration range，the inhibition intensities were proportional to the concentrations of cysteine.The linear range was 0.01-1.8μg/mL（r=0.994 6），and the detection limit（3σ）was 1.6 ng/mL.The relative standard deviation（RSD）was 0.72%for 1.0μg/mL cysteine（n=11）.The method can be expected to used to determine cysteine in real samples.

cysteine；inhibition；ceria nanoparticles；chemiluminescence

A

：1674-5124（2015）07-0037-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.07.009

2015-02-07；

：2015-03-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21275021）重慶市教委科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ1401201，KJ1401220）

石文兵（1976-），男，湖南鳳凰縣人，副教授，博士，主要從事藥物分析。