吳裕 張鳳良 毛常麗 曾建生 何美瑩

(云南省熱帶作物科學(xué)研究所，景洪，666100)

責(zé)任編輯:潘 華。

硬核(Scleropyrum wallichianum)是檀香科(Santalaceae)硬核屬(Scleropyrum)常綠小喬木，我國云南、海南、廣西等省區(qū)有野生分布，在云南主要分布在勐臘、景洪、勐海、孟連等地海拔700～1 600 m 的山地疏林中［1-3］。初步調(diào)查表明，硬核種群數(shù)量較大，開花結(jié)實(shí)正常，自然更新能力較強(qiáng)，種仁含油率高達(dá)70%，當(dāng)?shù)氐拇鲎?、基諾族、哈尼族等將硬核種子烤熟后舂碎作香料食用，其香味獨(dú)特［4-5］。據(jù)文獻(xiàn)記載，硬核種子油含亞油酸37.11%，亞麻酸37.81%［6］，另有文獻(xiàn)報(bào)道含有炔酸39%，可能有特殊工業(yè)用途［7］。因此初步認(rèn)為硬核有可能被作為云南特色經(jīng)濟(jì)植物或功能油料植物開發(fā)利用。

天然群體表型變異的研究能使我們認(rèn)識(shí)群體變異式樣，是引種馴化和遺傳育種的基礎(chǔ)，也是揭示其適應(yīng)性的有效途徑之一。種子形態(tài)是重要的表型性狀，被認(rèn)為在種內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，常常作為植物分類的依據(jù)，然而由于其所處地理位置、演替階段及更新方式的不同，植物種在群體間、群體內(nèi)單株間種子的形態(tài)存在很大差異［8-13］。種子的形態(tài)作為表型的重要研究內(nèi)容，對(duì)植物分類、發(fā)展演替、種群更新、物種保護(hù)及遺傳育種等都具有重要意義。目前關(guān)于硬核種子形態(tài)變異的研究文獻(xiàn)未見報(bào)道，本文選擇云南野生分布的硬核群體調(diào)查采樣，開展種子表型變異研究，探討群體間和群體內(nèi)種子變異程度，揭示種子表型變異規(guī)律，為硬核資源開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 群體選擇與樣品采集

在前期調(diào)查18 個(gè)樣點(diǎn)的基礎(chǔ)上［4］，根據(jù)各樣點(diǎn)的水平距離遠(yuǎn)近和天然隔離屏障等自然因子將16個(gè)樣點(diǎn)劃分為相對(duì)獨(dú)立的7 個(gè)野生群體(有2 個(gè)樣點(diǎn)因植株少而被刪除)。其中，景洪市包括2 個(gè)群體(基諾P1、勐旺P6)，勐臘縣包括3 個(gè)群體(象明P2、倚邦P3、易武P4)，孟連縣包括1 個(gè)群體(娜允P5)，勐海縣包括1 個(gè)群體(西定P7)。2014年8—9月份，硬核果實(shí)成熟時(shí)進(jìn)行采樣，選擇生長良好的植株，分單株記錄，采樣時(shí)保持株間距離大于50 m，以最大限度地排除近緣單株，同時(shí)盡量選擇表型差異大的植株，共采集到80 株樹的種子。采樣過程中用GPS 定位儀對(duì)每個(gè)群體進(jìn)行整體和單株定位，采樣群體代碼及其基本信息列于表1。

1.2 性狀選取與定量測(cè)定

以烘干種子為材料，對(duì)每株樹的種子隨機(jī)抓取30 粒，用游標(biāo)卡尺測(cè)量種子長和種子寬，測(cè)量精度為0.01 mm;用電子天平測(cè)單粒質(zhì)量，測(cè)量精度為0.001 g;不足30 粒者全部測(cè)定。測(cè)量數(shù)據(jù)計(jì)算算術(shù)平均值和種子長寬比。針對(duì)種子質(zhì)量性狀，描述種子形狀、種子先端、種子基部、種子刻紋深淺，并進(jìn)行編碼，編碼信息見表2。

表1 硬核采樣群體基本信息

表2 硬核種子質(zhì)量性狀分級(jí)代碼

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析方法

性狀變異特征:以種子長和寬的數(shù)據(jù)計(jì)算種子的長寬比。應(yīng)用Excel 2003 計(jì)算各性狀的平均值(X)、標(biāo)準(zhǔn)差(S)、變異系數(shù)(CV)、極差(R)、相對(duì)極差(RR)。用變異系數(shù)表示表型性狀的離散程度，用相對(duì)極差表示極端差異程度。RR=R/X，其中R=Xmax-Xmin。

方差分析和表型分化系數(shù):用SAS 軟件對(duì)各數(shù)量性狀采用巢式設(shè)計(jì)進(jìn)行方差分析［10-11］，線性模型為:Yijk=u+Si+T(i)j+e(ij)k，式中，Yijk為第i 個(gè)群體第j個(gè)單株第k 個(gè)觀測(cè)值;u 為總均值;Si為群體效應(yīng)(固定);T(i)j為群體內(nèi)單株效應(yīng)(隨機(jī));e(ij)k為試驗(yàn)誤差。

遺傳多樣性指數(shù):利用Shannon-Weaver 遺傳多樣性指數(shù)(Shannon Weaver index of genetic diversity)來衡量群體遺傳多樣性大小［14］。

統(tǒng)計(jì)分析的性狀分為兩類:第1 類為質(zhì)量性狀，統(tǒng)計(jì)各性狀類別的頻率分布(Pi)，用于計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)(H');第2 類為數(shù)量性狀，根據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差將材料分為10 級(jí)，從第1 級(jí)X1＜(x-2s)到第10 級(jí)X10≥(x+2s)，每0.5 s 為1 級(jí)，每一組的相對(duì)頻率(Pi)用于計(jì)算多樣性指數(shù)(H');計(jì)算公式H'=其中Pij為j 性狀在第i 個(gè)級(jí)別出現(xiàn)的頻率［15-16］。各個(gè)種群的多樣性指數(shù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行計(jì)算。

聚類分析:利用SAS 8.0 軟件采用最短距離法對(duì)7 個(gè)群體進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體間和群體內(nèi)的變異特征及變異來源

群體內(nèi)各表型性狀的變異系數(shù)存在差異，從表3可以看出，在所測(cè)量性狀中，單粒質(zhì)量的平均變異系數(shù)最大(22.07%)，種子長(8.66%)略大于種子寬(8.13%)。綜合分析各表型性狀可以看出，P1、P3 和P6 這3 個(gè)群體的變異較大，P5 最小。由群體平均值求得群體間各表型性狀的變異系數(shù)表明，單粒質(zhì)量的變異系數(shù)最大(8.04%)，種子長(3.68%)略大于種子寬(3.12%)。群體間各表型性狀的變異模式與群體內(nèi)的變異模式一致，但各表型性狀在群體間的變異系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于群體內(nèi)的變異系數(shù)。

極差是表示最大值與最小值之間的差距，用極差來比較同一性狀不同群體的極端變異程度比較直觀。但是，由于不同表型性狀間量綱不同，用極差進(jìn)行比較可比性差，故為了消除量綱差異使性狀間具有可比性，采用相對(duì)極差來表示各群體內(nèi)的極端變異程度，4 個(gè)性狀的極端變異按從大到小依次為:單粒質(zhì)量、種子長、種子長寬比、種子寬。種子表型性狀在7 個(gè)群體內(nèi)部的極端變化趨勢(shì)比較一致，其中P1、P6 變化較大，P5 最小。群體內(nèi)種子性狀相對(duì)極差的變化趨勢(shì)與其變異系數(shù)的變化趨勢(shì)比較吻合，具有較強(qiáng)的規(guī)律性。

表3 硬核種子長和寬的群體變異

巢式設(shè)計(jì)方差分析可以揭示性狀在群體內(nèi)和群體間兩個(gè)層次的差異性，且可以劃分出群體內(nèi)和群體間的變異組分，從而估量性狀變異的主要來源。對(duì)種子長、種子寬和單粒質(zhì)量3 個(gè)性狀進(jìn)行巢式方差分析(表4，表5)。分析表明，各表型性狀在群體內(nèi)差異均達(dá)到極顯著水平(p＜0.000 1)，在群體間差異均不顯著，說明在其群體內(nèi)存在豐富的變異，群體間變異不豐富;群體間各性狀的表型分化系數(shù)為4.47%～8.18%，均不到10%，即群體內(nèi)的平均表型變異占90%以上，說明群體內(nèi)的變異是云南野生硬核的主要變異來源。巢式方差分析的結(jié)果與變異系數(shù)的結(jié)果一致，綜合說明了群體內(nèi)的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于群體間的多樣性。

表4 硬核群體種子數(shù)量性狀方差分析結(jié)果

2.2 遺傳多樣性指數(shù)

對(duì)硬核種子質(zhì)量性狀(種形、先端、基部、刻紋深淺)及數(shù)量性狀(種子長、種子寬和單粒質(zhì)量)進(jìn)行了遺傳多樣性指數(shù)H'計(jì)算(表6)。總體來看，硬核群體內(nèi)質(zhì)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)為0.714～1.484，數(shù)量性狀的為1.929～2.111，幾個(gè)數(shù)量性狀的多樣性豐富程度都要高于質(zhì)量性狀。硬核種子的形狀多樣，但大多為倒卵圓形(59%)和近球形(22%);種子先端突尖大小呈兩極分化，大突尖占40%，微突尖占36%;基部形態(tài)從圓鈍到尖再到銳尖占的比例基本相等，從遺傳多樣性指數(shù)也看出，多樣性程度較豐富，具有廣泛的變異;刻紋深度大部分為中等類型(76%)，變異類型較單一，多樣性指數(shù)較低。80 株樹的種子4 個(gè)數(shù)量性狀從頻率分布來看，種子長21.63～26.18 mm 的占77%，種子寬17.19～20.53 mm 的占77%，單粒質(zhì)量2.80～4.59 g 的占80%，群體內(nèi)種子長、寬和單粒質(zhì)量多樣性比較豐富。

表5 硬核種子方差分量與表型分化系數(shù)

表6 硬核種子性狀分布頻率和多樣性指數(shù)

2.3 各表型性狀間及其與地理因子間的相關(guān)性

各性狀及其與地理因子之間的相關(guān)性分析表明(表7)，幾個(gè)質(zhì)量性狀間相關(guān)性較弱，相關(guān)系數(shù)為0.025～0.120，受地理因子的影響也較小;幾個(gè)數(shù)量性狀間均呈極顯著相關(guān)性(p＜0.01)，受環(huán)境影響也較大，尤其受海拔高度的影響更明顯(p＜0.01)，種子長、寬和單粒質(zhì)量隨海拔升高而減小，即高海拔地區(qū)的種子更小一些。各數(shù)量性狀及其與質(zhì)量性狀間有較好的相關(guān)性，較寬的種子一般基部較圓鈍、刻紋較深、種子較長、質(zhì)量較大;單粒質(zhì)量極顯著地受種子長和寬的影響，尤其與種子寬的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.901。需要說明的是，海拔1 100 m 的P5 與海拔1 260 m 的P1 和海拔1 390 m 的P4 種子性狀相近;P2 和P5 海拔相近，但P2 的種子卻明顯大得多?？梢哉J(rèn)為在緯度和海拔相近的條件下，種子大小隨經(jīng)度的變化表現(xiàn)出一定規(guī)律，即越往西種子越小，越往東種子越大。但是本研究采樣群體較少，尚需進(jìn)一步研究。

表7 硬核種子各性狀及其與地理因子間的相關(guān)系數(shù)

2.4 數(shù)量性狀的聚類分析

選取種子長、寬和單粒質(zhì)量3 個(gè)表型性狀進(jìn)行聚類分析，從聚類關(guān)系樹狀圖(圖1)可以看出，在閾值約為0.75 時(shí)可將7 個(gè)群體分為3 枝，其中海拔高度在1 100～1 390 m 之間的P1(基諾)、P5(娜允)、P6(勐旺)和P4(易武)聚為一枝，相似程度較高;海拔高度在1 430～1 580 m 之間的P3(倚邦)和P7(西定)聚為一枝，但相似程度相對(duì)較低;P2(象明)單獨(dú)為一枝(海拔1 130 m)。水平距離相近的群體沒有很好的聚在一起，而是海拔高度相近的群體聚在一起。需要說明的是，P2 和P5 海拔相近，但是P2 單獨(dú)分為一枝，P5 卻與海拔較高的P1 聚在一起。孟連縣與西雙版納州的同緯度同海拔地區(qū)相比，熱量較低，這可能是導(dǎo)致海拔1 100 m 的P5 與海拔1 260 m 的P1 性狀最相近的原因。如果不考慮P5，那么其它6 個(gè)群體的表型變異則隨海拔高度呈連續(xù)性。

圖1 硬核7 個(gè)群體種子性狀聚類關(guān)系樹狀圖

3 結(jié)論與討論

據(jù)7 個(gè)天然群體80 株樹的種子形態(tài)特征在表型變異系數(shù)和表型分化系數(shù)方面的分析結(jié)果，硬核種子大小和形態(tài)存在不同程度的變異。主要表現(xiàn)為群體內(nèi)的平均表型變異占93.72%，即硬核表型變異的主要來源是群體內(nèi)。聚類分析表明，水平分布相鄰的群體沒有很好的聚在一起，而是海拔高度相近的群體聚在一起(P2 除外)。海拔1 100～1 260 m的3 個(gè)群體(P1、P5、P6)平均種子長分別為24.79、24.66 和24.29 mm，平均種子寬為19.02、18.94 和18.95 mm，平均單粒質(zhì)量為3.75、3.80 和3.94 g;海拔1 430～1 580 m 的2 個(gè)群體(P3、P7)平均種子長為22.27 和22.37 mm，平均種子寬為18.88 和17.91 mm，平均單粒質(zhì)量為3.34 和3.17 g;單獨(dú)聚為一類的P2，平均種子長24.29 mm，平均種子寬為20.28 mm，平均單粒質(zhì)量為4.33 g。隨海拔升高，種子漸小，但是種子形態(tài)和種皮刻紋深淺受環(huán)境因子影響較小。

表型性狀既有變異性又具穩(wěn)定性，受其本身的遺傳組成和所處生態(tài)環(huán)境等方面的影響，反映了群體遺傳穩(wěn)定性與環(huán)境復(fù)雜性的互作關(guān)系。本研究7個(gè)群體3 個(gè)數(shù)量性狀在群體間的變異模式與群體內(nèi)一致，均表現(xiàn)為CV單粒質(zhì)量＞CV種子長＞CV種子寬，在其他樹種上也得到類似的變異模式［17-20］，說明這幾個(gè)表型性狀的變異趨勢(shì)相對(duì)穩(wěn)定，為選擇育種提供了依據(jù)。各性狀群體間的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于群體內(nèi)的變異系數(shù)，表明群體內(nèi)多樣性更豐富。同一性狀在不同群體內(nèi)變異系數(shù)也有一定的差異，但這種差異與水平分布和垂直分布都沒有規(guī)律。

聚類分析結(jié)果表明，7 個(gè)群體分為3 組，地理上相鄰的群體沒有很好的聚在一起，表現(xiàn)出表型性狀變異的不連續(xù)性。有研究證明，在一定的區(qū)域內(nèi)，海拔高差對(duì)種子形態(tài)特征構(gòu)成影響，高差約200 m 的種群，種子性狀差異顯著［21-22］。本研究中6 個(gè)群體分布在景洪、勐臘和勐海(瀾滄江流域)，北有青藏高原，東有哀牢山脈，阻障寒流入侵，同時(shí)受西部沙漠的干暖氣流影響，冬季溫暖而干燥;夏季，印度洋孟加拉灣和太平洋北部灣暖濕氣流順瀾滄江河谷北上，降雨豐富。采樣群體東西跨度約150 km，南北跨度約50 km，水平差異導(dǎo)致的生態(tài)環(huán)境變化不明顯，這可能是數(shù)量性狀變異與經(jīng)緯度不相關(guān)的原因;相比較而言，海拔從1 130 到1 580 m，海拔差異明顯影響降水量、氣溫、云霧等生態(tài)因子，海拔差異導(dǎo)致的環(huán)境異質(zhì)性明顯影響硬核種子的大小，表現(xiàn)為海拔越高，種子越小。

硬核的花極小，花粉量極少，花色不鮮艷，未發(fā)現(xiàn)明顯的氣味，這些性狀都不會(huì)被認(rèn)為具有遠(yuǎn)距離傳粉的可能性，然而群體間變異小，特別是質(zhì)量性狀變異更小，群體內(nèi)變異卻大，可以推測(cè)云南野生硬核大群體在很多年以前處于連續(xù)分布狀態(tài)，共享一個(gè)基因庫，隨著地理氣候變遷和森林群落的演替，使得硬核種群隔離，成了目前斑塊狀的分布格局。一般理論認(rèn)為，遺傳基礎(chǔ)比性狀更具有穩(wěn)定性，更能反應(yīng)群體的遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近，至于硬核這7 個(gè)群體間的遺傳多樣性分布式樣尚在研究過程中。

硬核果實(shí)和種子的形態(tài)特征在單株內(nèi)保持良好的一致性，其大小也比較均勻。定量分析群體內(nèi)種子形態(tài)多樣性的豐富程度表明，數(shù)量性狀多樣性的豐富程度都要高于質(zhì)量性狀。說明野生硬核種子形態(tài)特征主要受遺傳因素控制，環(huán)境因素在一定程度上起到修飾作用。種子大小雖然是一種簡單的生物學(xué)現(xiàn)象，但包含著豐富的內(nèi)容，種子大小具有重要的生態(tài)學(xué)意義，要深入分析影響種子大小的生態(tài)因子，尚需設(shè)計(jì)更精細(xì)的研究。

［1］ Wu Z Y，Raven P H，Hong D Y.Flora of China［M］.BeiJing:Science Press，2003.

［2］ 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志:24 卷［M］.北京:科學(xué)出版社，1988.

［3］ 中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志:4 卷［M］.北京:科學(xué)出版社，1986.

［4］ 吳裕，張鳳良，何美瑩，等.云南油料樹種硬核野生分布調(diào)查［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科技，2015，38(1):24-26.

［5］ 何美瑩，朱義鑫.西雙版納本土油料植物硬核研究初報(bào)［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科技，2015，38(1):36-39.

［6］ 王惠英，李延輝，李德厚，等.云南熱帶、亞熱帶油脂植物研究［C］//中科院西雙版納熱帶植物園.熱帶植物研究論文報(bào)告集.云南:云南人民出版社，1982.

［7］ 王靜萍，李京民，于鳳蘭.硬核油的炔酸成分研究［J］.云南植物研究，1992，14(1):101-104.

［8］ 李曉潔，徐化成.白皮松種子發(fā)芽習(xí)性及其種源變異的研究［J］.林業(yè)科學(xué)，1989，25(2):97-105.

［9］ 鐘章成.植物種群生態(tài)適應(yīng)機(jī)理研究［M］.北京:科學(xué)出版社，2000.

［10］ 陳小勇.黃山青岡種子形態(tài)變異的初步研究［J］.種子，1994(5):16-19.

［11］ 操國興，鐘章成，謝德體，等.縉云山川鄂連蕊茶種子形態(tài)變異的初步研究［J］.西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25(2):105-107.

［12］ 蔡琰琳，金則新.瀕危植物夏蠟梅果實(shí)、種子形態(tài)變異研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，23(3):44-49.

［13］ 唐玲，王艷芳，李榮英，等.滇重樓不同居群的表型多樣性研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29(18):89-95.

［14］ Shannon C E，Weaver W.The mathematical theory of communication［M］.Urbana:University of Illinois Press，1949.

［15］ 趙香娜，李桂英，劉洋，等.國內(nèi)外甜高梁種質(zhì)資源主要性狀遺傳多樣性及相關(guān)性分析［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008，9(3):302-307.

［16］ 董玉琛，曹永生，張學(xué)勇，等.中國普通小麥初選核心種質(zhì)的產(chǎn)生［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2003，4(1):1-8.

［17］ 李斌，顧萬春，盧寶明.白皮松天然居群種實(shí)性狀表型多樣性研究［J］.生物多樣性，2002，10(2):181-188.

［18］ 曾杰，鄭海水，甘四明，等.廣西西南樺天然居群的表型變異［J］.林業(yè)科學(xué)，2005，41(2):59-65.

［19］ 蔡琰琳，金則新.瀕危植物夏蠟梅果實(shí)、種子形態(tài)變異研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，23(3):44-49.

［20］ 孫玉，李慶梅，楊敬元，等.秦嶺冷杉球果與種子的形態(tài)變異［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25(1):176-181.

［21］ 李世超，楊樹華，劉海星，等.天山地區(qū)彎刺薔薇居群表型多樣性的研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，2014，41(8):1723-1730.

［22］ 孫玉玲，李慶梅，楊敬元，等.秦嶺冷杉球果與種子的形態(tài)變異［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，25(1):176-181.