何志明

臨床醫(yī)學(xué)

成人股骨頭缺血性壞死中轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的表達(dá)研究

何志明

目的通過對壞死股骨頭進(jìn)行轉(zhuǎn)化生長因子及血管內(nèi)皮因子的檢驗, 更深入地掌握股骨頭缺血性壞死的發(fā)生進(jìn)展規(guī)律, 更深入地探討股骨頭缺血性壞死的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。方法采集30例髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者的股骨頭作為標(biāo)本,15例股骨頭缺血性壞死的病例作為試驗組,15例股骨頸囊內(nèi)骨折的病例作為對照組。將標(biāo)本送實驗室行免疫組織化學(xué)技術(shù)檢驗, 即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)), 對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。結(jié)果對照組壞死區(qū)及其周圍區(qū)域均有轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的陽性表達(dá), 本實驗中股骨頭缺血性壞死區(qū)表達(dá)最少, 對照組表達(dá)居中, 股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)表達(dá)最多。結(jié)論①轉(zhuǎn)化生長因子及血管內(nèi)皮因子在股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)的表達(dá)明顯增強, 說明股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)局部有良好的修復(fù)力, 在股骨頭缺血性壞死病理形成中起著非常重要的作用, 與新骨的形成以及肉芽組織與纖維組織大量增生有關(guān)。②轉(zhuǎn)化生長因子及血管內(nèi)皮因子在股骨頭缺血性壞死區(qū)表達(dá)不足, 與壞死骨修復(fù)的失敗有非常密切的關(guān)系, 說明該區(qū)缺少修復(fù)活動能力。

股骨頭缺血性壞死；轉(zhuǎn)化生長因子；血管內(nèi)皮因子；免疫組織化學(xué)技術(shù)；組織病理學(xué)

轉(zhuǎn)化生長因子屬于一個超級家族的相關(guān)蛋白成員, 轉(zhuǎn)化生長因子在骨組織、血小板、軟骨中含量豐富。骨的形成、生長、壞死后的修復(fù)均與轉(zhuǎn)化生長因子有著密切關(guān)系[1]。轉(zhuǎn)化生長因子在骨痂形成與塑形中起著重要作用[2]。骨母細(xì)胞和軟骨細(xì)胞富含轉(zhuǎn)化生長因子受體, 轉(zhuǎn)化生長因子已被證實能夠刺激軟骨內(nèi)化骨。各種基礎(chǔ)研究證實[3], 轉(zhuǎn)化生長因子在不同的效應(yīng)細(xì)胞中也表現(xiàn)出不同效應(yīng), 具有雙向調(diào)節(jié)性。在發(fā)生組織損傷后轉(zhuǎn)化生長因子在修復(fù)進(jìn)程中起著非常重要的作用。如果轉(zhuǎn)化生長因子過量表達(dá)就會出現(xiàn)肉芽組織過度增生甚至慢性纖維化。血管內(nèi)皮因子與多種組織器官肉芽組織過度增生、纖維化也有密切的關(guān)系。目前關(guān)于成人股骨頭缺血性壞死轉(zhuǎn)化生長因子或血管內(nèi)皮因子方面的研究報道還很少[4]。通過對壞死股骨頭進(jìn)行轉(zhuǎn)化生長因子及血管內(nèi)皮因子的檢驗, 可以更準(zhǔn)確地認(rèn)識股骨頭發(fā)生缺血性壞死的發(fā)展規(guī)律, 對于進(jìn)一步深入探討股骨頭發(fā)生缺血性壞死的分子生物學(xué)基礎(chǔ)是有益的, 也能夠為臨床進(jìn)行股骨頭缺血性壞死的治療提供一定的方向[5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實驗用的股骨頭標(biāo)本都是來自佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院骨科行髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者, 共30例, 其中女12例, 男18例, 實驗室檢查類風(fēng)濕因子陰性, 抗O抗體＜500單位, 血常規(guī)及血沉都正常。15例股骨頭缺血性壞死者作為試驗組,15例股骨頸囊內(nèi)骨折者作為對照組, 試驗組中女9例, 男6例, 年齡25～60歲, 平均年齡48.2歲, 主要表現(xiàn)為：患側(cè)髖部疼痛(可有靜息痛), 活動后加劇, 患者髖關(guān)節(jié)活動受限, X光影像學(xué)表現(xiàn)為股骨頭發(fā)生扁平甚至塌陷。對照組中女3例, 男12例, 年齡59～98歲, 平均年齡68.5歲, 來源為因外傷行髖關(guān)節(jié)置換的手術(shù)者, 手術(shù)均在7 d內(nèi)完成, 受傷前無髖關(guān)節(jié)疼痛、活動受限等癥狀, 檢查未發(fā)現(xiàn)股骨頭缺血性壞死的醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1.2 主要儀器與試劑 低溫超速離心機, 烤箱, 自動照相顯微鏡, 低溫冰箱, 轉(zhuǎn)化生長因子及血管內(nèi)皮因子免疫組織化學(xué)技術(shù)試劑盒, 烘片機, 恒低溫冰凍切片機, 全自動組織脫水機, 攤片機, 超低溫冰箱。

1.3 方法 試驗組標(biāo)本是手術(shù)病例切除的股骨頭, 在切出時立即選取5 mm×5 mm大小的壞死中心骨組織和壞死周邊骨組織各1塊, 吸干血跡, 馬上浸入濃度為4％的福爾馬林液中, 保存在4℃冰箱內(nèi)。標(biāo)本經(jīng)濃度為4％福爾馬林液固定。對照組則取相應(yīng)部位骨組織。用上述方法制作5 μg冰凍切片,做免疫組織化學(xué)技術(shù)染色。免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理, 通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)), 對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。

1.4 操作流程 ①脫鈣, 標(biāo)本脫水；②透明；③浸蠟, 包埋；④切片；⑤烤箱加熱；⑥免疫組織化學(xué)技術(shù)染色；⑦滅活內(nèi)源性酶；⑧加滴封閉；⑨稀釋；⑩滴加生物素化；?滴加試劑SABC；?顯色；?復(fù)染；?脫水；?二甲苯洗滌；?樹膠封片；?微鏡鏡檢。

1.5 免疫組織化學(xué)技術(shù)染色結(jié)果觀察 positive reaction呈淺黃色至深棕黃色顆粒狀, 無positive reaction為陰性(-)。淺黃色(+), 黃色(++), 深黃色(+++)。為評估轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子免疫染色細(xì)胞的數(shù)量, 在呈positive reaction病例中,每例隨機進(jìn)行鏡下檢查10個不同視野累計200個細(xì)胞計數(shù)相應(yīng)免疫染色的百分率[6]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化生長因子在試驗組股骨頭缺血性壞死區(qū)較低, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 血管內(nèi)皮因子在試驗組股骨頭缺血性壞死區(qū)較低, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組壞死區(qū)與對照組的表達(dá)情況(±s)

表1 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組壞死區(qū)與對照組的表達(dá)情況(±s)

注：與對照組比較,aP＜0.05

組別 例數(shù) 轉(zhuǎn)化生長因子 血管內(nèi)皮因子試驗組(壞死區(qū)) 15 12.89±4.01a 11.29±1.56a對照組 15 18.56±3.25 16.78±1.42

2.2 轉(zhuǎn)化生長因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)較高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 血管內(nèi)皮因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)亦較高, 與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組壞死周圍區(qū)與對照組的表達(dá)情況(±s)

表2 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組壞死周圍區(qū)與對照組的表達(dá)情況(±s)

注：與對照組比較,aP＜0.05

組別 例數(shù) 轉(zhuǎn)化生長因子 血管內(nèi)皮因子試驗組(周圍區(qū)) 15 26.89±2.23a 38.29±3.15a對照組 15 18.56±3.25 16.78±1.42

2.3 轉(zhuǎn)化生長因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)較高,與壞死區(qū)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05), 血管內(nèi)皮因子在試驗組股骨頭缺血性壞死周圍區(qū)較高, 與壞死區(qū)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組病理壞死區(qū)與病理周圍區(qū)表達(dá)情況(±s)

表3 轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子在試驗組病理壞死區(qū)與病理周圍區(qū)表達(dá)情況(±s)

注：與病理壞死區(qū)比較,aP＜0.05

分區(qū) 例數(shù) 轉(zhuǎn)化生長因子 血管內(nèi)皮因子病理壞死區(qū) 15 12.89±4.01 11.29±1.56病理周圍區(qū) 15 26.89±2.23a 38.29±3.15a

3 討論

股骨頭缺血性壞死在缺血壞死的早期, 還沒有發(fā)生明顯影像學(xué)改變時, 已有骨損傷(鏡下骨折等), 因此, 局部的分子必然會啟動一個骨折修復(fù)程序, 但是如何啟動并不清楚。實驗表明在周圍區(qū)轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子為高表達(dá),而在壞死區(qū)則為低表達(dá), 增加轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的表達(dá)應(yīng)該能促進(jìn)修復(fù)的進(jìn)度[7]。假設(shè)股骨頭缺血性壞死在缺血壞死早期進(jìn)行人為的干預(yù), 增加轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的表達(dá), 促進(jìn)修復(fù)進(jìn)度, 使修復(fù)快于壞死, 也許能夠治愈股骨頭缺血性壞死。目前已有大量的轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子針對如何進(jìn)行組織的修復(fù)和組織的纖維化相關(guān)性治療嘗試, 對于股骨頭缺血性壞死的防治有很好的啟迪作用[8], 本課題有關(guān)的分子生物學(xué)研究結(jié)果, 不僅對以后繼續(xù)深入探討打下基礎(chǔ), 也為針對股骨頭缺血性壞死治療的分子介入治療提出了另一個問題：如何防止轉(zhuǎn)化生長因子與血管內(nèi)皮因子的過度表達(dá)造成大量纖維組織與肉芽組織增生乃至瘢痕化從而導(dǎo)致新骨形成障礙的不良后果。

[1]Mont MA, Einhorn TA, Sponseller PD, et al. The trapdoor procedure using autogenous cortical and cancellous bone grafts for osteonecrosis of he femoral head. J Bone Joint Surg(Br),1998,80(1):56-62.

[2]Breibart AS, Grande DA, Kessler R, et al. Tissue engineering bone re-pair of calvarial defects using cultured periosteal cells. Plastic Reconstr Surg,1998,101(3):567.

[3]王坤正, 同志勤, 王春生, 等.吻合血管游離腓骨移植治療股骨頭缺血性壞死.中華顯微外科雜志,2000,23(4):254-256.

[4]黃克勤.實用股骨頭缺血性壞死診治.北京:人民衛(wèi)生出版社,1999:126.

[5]林喬齡, 張嵩圖, 陳聯(lián)源, 等.股骨頭缺血壞死發(fā)病機理的病理研究.中國骨傷,2001,14(3):150-151.

[6]張會生, 賈衛(wèi)斗.非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死免疫組織化學(xué)技術(shù)與病理改變研究.張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2003,20(1):19.

[7]孫建, 龐清江.股骨頭血供及股骨頸骨折血管破壞研究進(jìn)展.現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué),2006,18(3):203-209.

[8]李喜東, 范力軍, 李國力, 等.介入治療股骨頭激素性壞死的實驗研究.中華放射學(xué)雜志,1998,32(1):32-35.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.07.012

2014-12-12]

廣東省佛山市醫(yī)學(xué)科研立項(項目編號：2013448)

528100 廣東省佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院