李妍妍 戴 娟 胡玲萍 江振洲 尚 靖 張陸勇①

(1. 國家南京新藥篩選中心 中國藥科大學 南京 210009; 2. 寧波大學海洋學院 寧波 315211)

海參是棘皮動物門、海參綱動物的通稱, 為重要的海洋無脊椎動物, 分布于世界各海洋中。仿刺參(Apostichopus japonicus), 又名 Stichopus japonicus,也稱刺參, 屬棘皮動物門(Echinodermata)、海參綱(Holothuroidea)、楯手目(Aspidochirotida)、刺參科(Stichopodidae)、仿刺參屬(Apostichopus)動物。海地瓜俗稱香參, 也稱白參、茄參、海茄子, 屬棘皮動物門、海參綱、芋參目(Molpadida)、尻參科(Caudinidae)、海地瓜屬(Acaudina)動物。該屬有兩個種——白肛海地瓜(Acaudina leucoprocta)和海地瓜(Acaudina molpadioides), 廣泛分布于我國東南沿海。海地瓜盛產于亞熱帶沙質海區(qū), 在我國浙江、福建、廣東、海南等沿海區(qū)域均有分布, 蘊藏量十分豐富(張鳳瀛等,1964; 侯付景等, 2010a)。

海參是海洋中重要的食物和藥物資源。含有海參多糖、海參皂苷、膠原和脂肪酸等多種生理活性物質(崔鳳霞等, 2006; 趙芹等, 2008; 佟長青等, 2013)。海參的營養(yǎng)十分豐富, 位于海產品“八珍之首”, 是滋補強身的名貴佳品及防治一些疾病的良藥。清朝趙學敏編的《本草綱目拾遺》有這樣的敘述:“海參性溫補, 足敵人參, 故名海參; 味甘咸, 補腎經, 益精髓,消痰延, 攝小便, 壯陽療痿, 殺瘡蟲”, 以及“生百脈血, 治本息痢”。臨床上先后有中醫(yī)提出以海參單用或組方治療腫瘤、再生障礙行貧血和糖尿病取得良好效果的報告, 此外在慢性腎炎、高血壓、肺結核、神經衰弱、慢性乙型肝炎、等常見病治療和用于病后或產后康復過程中的各種藥膳中頻繁出現(xiàn)(閆冰等,2004; 邢湘臣, 2006; 肖楓等, 2006)。海參體壁是主要的食用或藥用部位。不同種類和來源的海參, 由于生活的海域、環(huán)境不同, 所攝食物各異, 其營養(yǎng)價值和功效存有差異, 并且為了深入研究海參的藥理活性及作用機制, 尋找針對不同種海參最適的多肽制備方法是必不可少的。相對于化學法, 酶解法獲得的產物活性更高, 且更為方便、易控制, 但是酶解的最適條件還未見報道。

本實驗選擇仿刺參和海地瓜為實驗材料, 在單因素實驗研究的基礎上, 利用響應面設計得到復合蛋白酶(傅玉穎等, 2009; 于平等, 2013)水解海參體壁的最優(yōu)水解條件, 水解液離心、超濾后冷凍干燥得到樣品后, 通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化,利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)鑒定, 再用蛋白測序儀分析氨基酸組成, 為進一步研究這些海參的活性成分的生理功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參取于寧波奉化博旺水產養(yǎng)殖公司。海地瓜取自浙江象山隅山島海域。復合蛋白酶(1.0×105U/g)購于廣西南寧龐博生物工程有限公司。乙腈、甲醇為色譜級, 均購于寧波奧博科學儀器有限公司; 氨基酸標準品、衍生化試劑購于 SIGMA公司, 三氟乙酸(TFA)、聚凝胺(Polybrene)等試劑均為市售, 分析純;玻璃纖維膜、PTFE濾膜(日本島津公司)。

Agilent1200液相色譜儀(美國安捷倫科技公司),Agilent 7890氣相色譜儀(美國安捷倫科技公司),MALDI-TOF-Target(美國Bruker Daltonics公司), Zip TipC4(美國 Millipore公司), 蛋白測序 PPSQ-31A(日本島津公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 取新鮮海參洗凈后解剖, 去除內臟和內壁肌肉層, 剩余體壁切成碎塊。加入一定量的水和復合蛋白酶在一定條件下進行水解, 水解液于 95°C, 滅酶 5min, 冷卻至室溫后, 12000r/min,4°C冷凍離心10min。取部分上清液檢測相關指標,另一部分上清依次用分子量為 5kDa、1kDa的Milipore超濾膜抽濾, 濾液冷凍干燥得到凍干粉用于進一步分析(魏廣東等, 2005; 劉程惠等, 2008;Wu et al, 2012)。

1.2.2 測定方法

(1) 氨基態(tài)氮的測定 甲醛滴定法, 稱取相同的兩份樣品溶于50mL去離子水中, 一瓶加入2滴中性紅指示劑, 用0.100 mol/L NaOH溶液滴定終點(由紅色變?yōu)殓晟?, 記錄堿用量 V1, 另一份加入麝香草酚酞3滴及中興甲醛20mL, 搖勻, 用0.100 mol/L NaOH溶液滴定至淡藍色, 記錄堿用量V2(魏廣東等,2005; 侯付景等, 2010b)。按下述公式計算:

氨基態(tài)氮(%) = {[N×(V2－V1)×0.014] / W}×100式中, N為標準堿液當量濃度; W為樣品的重量(g)。

(2) 總氮的測定 凱氏定氮法(魏廣東等,2005)。水解度的計算:

DH(%) = (水解液中氨基態(tài)氮 / 樣品總氮量)×100

1.2.3 響應面設計 本實驗使用復合蛋白酶, 在不同條件下水解海參制得水解液, 以水解度為指標優(yōu)化水解條件。實驗因素包括時間(60, 120, 180min)、溫度(45, 55, 65°C)和加酶量(0.5%, 1.5%, 2.5%)。采用Box-Behnken中心組合設計(王霞等, 2010; 羅紅宇等,2013; 孫靜等, 2013; 李云濤等, 2014)。

1.2.4 酶解產物分析

(1) RP-HPLC分離純化 取超濾分離所得的仿刺參和海地瓜的凍干粉各5mg溶于1mL蒸餾水(含0.1% TFA), 配制成5mg/mL的樣品。經0.45μm微孔濾膜過濾后, 進行RP-HPLC分離純化。重復進樣, 收集單一主要組分峰流出液, 冷凍干燥后－20°C保存,用于質譜分析(胡文婷等, 2006)。

色譜柱: Zorbax 300SB-C18 (4.6×250mm, 5μm);流速0.8 mL/min; 進樣量100μL; 流動相A為水, 流動相 B為乙腈(0.1% TFA), 洗脫梯度: 0%—50% B,32min; 50%—100% B, 2min; 100%—100% B, 3min。檢測波長: 280nm/254nm/214nm (Silva et al, 2007;Mant et al, 2009)。

(2) MALDI-TOF質譜檢測 經兩步RP-HPLC分離純化后所得單一活性峰凍干粉, 用蒸餾水(含0.1% TFA)溶解?；|溶液為含有5mg/mLα-氰基-4-羥基肉桂酸(4-HCCA)及0.1% TFA的50%乙腈(ACN)溶液。取樣品溶液和基質溶液各1mL混合均勻, 采用ZIP TIP C4槍頭吸取樣品10μL, 脫鹽濃縮后, 用1μL TA液(0.1% TFA的50% CAN)洗出樣品, 直接點在樣品靶上, 自然干燥后, 吸取 0.6μL基質溶液覆蓋在樣品及校準標準品上, 室溫揮干, 送入離子源中檢測(Hinke et al, 2002; Villanueva et al, 2004)。

檢測條件: N2激光器, 激光波長355nm, 采用延時引出和反射的工作方式; 加速電壓 20kV, 檢測器電壓1kV, 頻率220Hz, 延遲時間190ns, 陽離子方式檢測, 圖形疊加100次單次掃描信號得到質譜圖。

(3) 多肽 N端測序 利用混合氨基酸標準品(PTH-AA), 建立標準氨基酸圖譜。取15μL聚凝胺加至玻璃纖維膜上, 氮氣吹干, 上機運行5個循環(huán)。再將足量樣品點加到玻璃纖維膜上, 氮氣吹干。將加好樣品的玻璃纖維膜用 PTFE濾膜封置于蛋白測序儀PPSQ-31A的反應器里, 設定檢測氨基酸數(shù)及其它參數(shù)。

2 結果與分析

2.1 響應面法優(yōu)化

應用響應面設計, 水解度為指標, 建立數(shù)學模型。根據單因素實驗設計考慮了溫度、時間和加酶量3個因素。采用Box-Behnken中心組合設計, 共設計15個實驗點, 分為析因點和零點。其中析因點為自變量取值在 A、B、C 所構成的三維頂點, 零點為區(qū)域的中心點(見表1)。

表1 響應面設計方案和實驗結果Tab.1 Design and experimental results of RSM (respond surface methodology)

表2 響應面回歸方程的方差分析結果Tab.2 Analysis of variance results for response surface quadratic model

2.2 模型建立和顯著性分析

根據表2的結果, 用軟件Design Expert 8.0設計的實驗方案, 對數(shù)據進行多元回歸擬合, 得到回歸方程:DH1(%) = 80.18 + 5.53A + 2.83B + 10.09C – 5.90AB +0.95AC – 0.13BC – 9.99A2– 7.85B2– 11.09C2DH2(%) = 63.44 – 0.78A + 0.73B + 1.95C + 0.91AB –0.97AC – 0.83BC – 5.16A2– 5.44B2– 5.14C2式中, A、B、C 均為編碼值。

據表 2對回歸線方程(沈懋文, 2010; 孫靜等,2013)進行顯著性分析, 仿刺參水解度回歸方程的顯著性檢驗P=0.0395 (P＜0.05), 海地瓜水解度回歸方程的顯著性檢驗P=0.0025 (P＜0.05), 說明這兩種海參水解度回歸模型的預測值與實際值都非常吻合, 模型顯著; 模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率, 仿刺參回歸方程的失擬項檢驗 P=4.07(P＞0.05), 海地瓜水解度回歸方程的失擬項檢驗P=0.0622 (P＞0.05), 說明兩個方程對實驗的擬合度均較好, 因此所選的二次回歸模型有效, 可用這兩個模型分析和預測實驗數(shù)據。

圖1 仿刺參體壁水解條件對DH1(%)影響的響應面圖Fig.1 3-D surface and contour plots showing the effect of hydrolysis conditions on DH1

圖2 海地瓜水解條件對DH2(%)影響的響應面圖Fig.2 3-D surface and contour plots showing the effect of hydrolysis conditions on DH2

2.3 響應面分析

根據三維立體圖可對任何兩個因素的交互作用及各因素對響應值的影響進行分析, 確定最佳因素水平。圖1的a、b、c分別表示時間和溫度、時間和加酶量、溫度和加酶量三組因素對水解度的影響。通過響應面三維圖的等高線圖的形狀則可以直觀地反映兩因素交互作用的強弱, 橢圓表示交互作用顯著,越接近圓形表示兩因素交互作用越弱。

由圖 1可知, 等高線呈橢圓形, 表示溫度和時間、時間和加酶量、溫度和加酶量的交互作用均比較明顯。隨著加酶量的增加, 水解度呈先上升后下降的趨勢。實驗范圍內加酶量較低時等高線排列密集, 間距較窄, 對仿刺參水解度影響較大, 反之, 影響較小。溫度和時間曲線比較平緩, 在實驗范圍內對仿刺參水解度影響不明顯。

由圖2可知, 等高線呈近似圓形, 說明各圖中的兩因素交互作用均不明顯。隨著加酶量的增加, 海地瓜水解度先上升后下降。因為酶只有與底物結合, 才能起到催化作用, 當?shù)孜镆欢〞r, 加酶量增大, 底物與酶完全結合, 從而加速降解。隨著時間的增加, 海地瓜水解度出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。可能是由于時間過長, 部分產物進一步降解導致的。隨著溫度的升高, 水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢?？赡苁且驗槊傅幕钚噪S溫度升高而逐漸增強, 當超過一定范圍內反而使部分酶失活。

對響應面結果利用軟件進行優(yōu)化分析, 確定仿刺參水解的最優(yōu)條件: 時間為 136.8min, 溫度為55.7°C, 加酶量為1.97%, 響應面預測的DH1最大值為83.41%。海地瓜水解的最優(yōu)條件: 時間為115.6min,溫度 55.4°C, 加酶量 1.70%。在此條件下, 響應面預測的DH2最大值為63.68%。用上述優(yōu)化條件進行實驗, 得到的DH1和DH2分別為83.39%、63.69%, 與理論值基本相符。

2.4 RP-HPLC分離純化

將超濾分離后的仿刺參多肽組分S和海地瓜多肽組分 A 的凍干粉溶于蒸餾水(含 0.1% TFA)配成5mg/mL的樣品, 上 RP- HPLC分離純化。經第一步RP-HPLC分離, 組分 S被分離成 42個組分(圖 3a, 圖3b), 組分A也被分離成42個組分(圖4c)。從色譜圖可以看出, 經二次 RP-HPLC再次純化, 在上述色譜條件下, 仿刺參和海地瓜酶解肽段得到基線分離, 酶解肽段分離是較成功。另外從三批酶解肽段的色譜圖譜 (圖譜沒有給出), 各批間的肽譜大致相同。組分S被分離成26個組分(圖3d)和12個組分(圖3e), 組分A被分離成18個組分。重復進樣, 合并主要單一組分峰(S1、S2、A1、A2)收集起來, 冷凍干燥, 將得到的凍干樣品用于MALDI-TOF質譜分析, 進而對主要肽段序列進行鑒定。

2.5 MALDI-TOF鑒定

經二次RP-HPLC純化得到的主要單一組分(S1、S2、A1、A2)進行 MALDI-TOF分析, 測定其相對分子質量。各組分的質譜圖如圖 4(僅測 Mr=1000—5000)。S1峰(圖4a)主要以3126.732為主, 摻雜部分為干擾物。S2峰(圖 4b)以 1919.789、2004.802、3141.300為主, 包含其它小峰雜質, 及其斷裂氨基酸殘基后的組分。A1峰(圖 4c)含有 3個組分, 以4370.600為主; 組分2781.575易脫落精氨酸, 產生以2625.412為主較穩(wěn)定的物質, 組分 3035.719與3191.550可能是峰組分中殘余的雜質。A2 峰(圖4d)有2個組分: 2632.297和2863.417, 這兩個組分在質譜檢測中極易丟失蘇氨酸殘基, 從而產生較穩(wěn)定的組分2531.243與2762.374。

圖3 多肽的RP-HPLC分析圖譜Fig.3 Analytical RP-HPLC chromatogram of polypeptide

2.6 N端測序

圖4 多肽的MALDI-TOF質譜圖Fig.4 The MALDI-TOF spectrum of polypeptide

圖5 多肽N端測序圖Fig.5 N sequencing diagram of polypeptide

經N端序列測定仿刺參多肽S1、S2氨基酸殘基序列分別為: Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ser-Ala-Leu (圖5a)和 Trp-Pro-Pro-Gly-Asn-Ser-Gly-Ile-Gln-Gly (圖 5b)。海地瓜多肽 A1和 A2氨基酸殘基序列分別為Gly-Ala-Asn-Gly-Asn (圖 5c)和 Trp-Leu-Pro-Gly-Asp-Thr-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Thr-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly (圖 5d)。

3 討論

海參酶解得到的多肽也較為繁多且分子量較低。在色譜分析過程中部分肽段未能得到完全的分離。反相分離中樣品保留時間受其疏水性和分子量的影響,在分子量相同的情況下, 疏水性低的分子在色譜柱中的保留時間較短; 而疏水性相同的情況下, 分子量低的組分保留時間較短。膠原蛋白水解物中存在許多分子量十分接近的肽段, 其理論疏水性差異不明顯。因此利用反相色譜完全分離這些肽段存在一定難度。另外, 肽段中含有較多的甘氨酸, 導致不同肽段之間紫外特征吸收差異不是很顯著。因此, 在反相分離過程中利用紫外檢測肽段之間的差異受分離度影響很大。

在質譜分析中, 不同組分的分離度對定性研究的結果影響較小, 但受單位時間掃描次數(shù)的影響, 以盡可能多地檢測同一色譜峰中的離子。在樣品分析過程中降低了液相的流速, 同時將動態(tài)排除的次數(shù)和動態(tài)排除時間作了調整。實驗結果也表明了該方法的有效性, 不同膠原蛋白的酶法降解物中含有序列完全相同的肽段, 這些肽段不能用于膠原蛋白的類型識別, 而許多特征肽段只出現(xiàn)在特定的膠原蛋白序列中。這些特征肽段可作為膠原蛋白的類型識別的依據, 因此特征肽段的識別是判斷膠原蛋白類型的關鍵。本研究證明利用酶法降解膠原蛋白可得到多種特征肽段。通過 RP-HPLC/MALID-TOF質譜識別降解產物的特征組分進行膠原蛋白類型檢測及多種膠原蛋白同步檢測具有可行性。在實際操作中, 可將待測樣品熱變性和酶切處理, 利用液質聯(lián)用技術檢測特征肽段進行膠原蛋白類型別。而該方法在臨床上的應用則需要使用更多類型的膠原蛋白進行更為深人的實驗驗證。

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