張宇霞，昝占全，王統(tǒng)霞，李春梅，紀(jì)蘭菊#（.青海益欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，西寧 80003；2.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所/中國(guó)科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 8000；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 00049）

丹珍頭痛膠囊是青海益欣藥業(yè)有限責(zé)任公司原研獨(dú)家產(chǎn)品，由高原丹參、夏枯草、熟地黃、珍珠母、雞血藤、川穹、當(dāng)歸、白芍、菊花、蒺藜、鉤藤、細(xì)辛共十二味中、藏藥材組成，具有平肝熄風(fēng)、散瘀通絡(luò)、解痙止痛的功效，可用于肝陽(yáng)上亢、瘀血阻絡(luò)所致的頭痛、背痛頸酸、煩躁易怒等癥，特別是針對(duì)腦供血不足、高血壓腦外傷后遺癥、偏頭痛、神經(jīng)衰弱、頸椎病等引起的多發(fā)性、慢性頭痛具有療效顯著、標(biāo)本兼治的綜合效果，在臨床上用于治療偏頭痛[1]、血管神經(jīng)性頭痛[2]。

患者用藥的安全性與藥品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高密切相關(guān)。目前，丹珍頭痛膠囊標(biāo)準(zhǔn)中可監(jiān)控的藥材僅有高原丹參[薄層色譜（TLC）鑒別丹參酮ⅡA]和白芍[TLC鑒別芍藥苷、含量測(cè)定芍藥苷）兩味藥材。筆者曾對(duì)該藥品中其他藥材的主要成分進(jìn)行了TLC鑒別及高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定含量，以期完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但都受到了不同程度陰性干擾?；瘜W(xué)指紋圖譜可用于全面評(píng)價(jià)藥材或者藥品的質(zhì)量，如紅外指紋圖譜[3]、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）指紋圖譜[4]、HPLC 指紋圖譜[5]、TLC 指紋圖譜[6]等。由于該藥品中含中藥材種類較多，化學(xué)成分復(fù)雜，考慮到指紋圖譜可以全面反映樣品中的化學(xué)信息，同時(shí)近年來(lái)HPLC指紋圖譜用于藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)也較多[7-10]，在本研究中筆者對(duì)丹珍頭痛膠囊進(jìn)行了HPLC指紋圖譜研究并對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，以為完善丹珍頭痛膠囊的質(zhì)量控制方法提供參考。

1 材料

515型HPLC儀，包括溶劑管理系統(tǒng)、二極管陣列檢測(cè)器、Empower 色譜工作站（美國(guó)Waters 公司）；KQ-100B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ESJ182-4型電子天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）。

丹珍頭痛膠囊（批號(hào)：20131105、20131203、20131204、20140602、20140603、20140607、20140608、20140609、20140 601、20140602，編號(hào)為S1～S10）由青海益欣藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；阿魏酸、芍藥苷、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡?；鼘幩?、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、迷迭香酸對(duì)照品的質(zhì)量濃度分別為0.012 0、0.029 4、0.030 9、0.040 9、0.030 5、0.136 0、0.016 0、0.312 0 mg/ml（批號(hào)分別為MUST-13090901、MUST-11090902、MUST-11090911、MUST-12090901、MUST-14090901、MUST-14090908、MUST-15090906、MUST-16090903）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為甲醇-乙腈（1∶1，V/V），梯度洗脫（0～10 min，15%→25%B；10～20 min，25%→40%B；20～60 min，40%→90%B；60～65 min，15%B）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：340 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μl；記錄時(shí)間：65 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取阿魏酸、芍藥苷、綠原酸、木犀草苷、3，5-O-雙咖啡?；鼘幩?、丹酚酸B、丹參酮ⅡA、迷迭香酸對(duì)照品各適量，加入甲醇制成每1 ml 含0.012 0 mg 阿魏酸、0.029 4 mg 芍藥苷、0.030 9 mg 綠原酸、0.040 9 mg 木犀草苷、0.030 5 mg、3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸、0.136 0 mg 丹酚酸B、0.016 0 mg 丹參酮ⅡA和0.312 0 mg 迷迭香酸的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 將丹珍頭痛膠囊粉末過(guò)七號(hào)篩，精密稱取約1.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，回流提取2 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足缺失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果，相似度均為0.90以上。以第11號(hào)峰為對(duì)照峰S，測(cè)定6次色譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積比值的一致性。結(jié)果，RSD分別為0.09%（阿魏酸）、0.10%（芍藥苷）、0.20%（綠原酸）、0.15%（木犀草苷）、0.12%（3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸）、0.09%（丹酚酸B）、0.12%（丹參酮ⅡA）、0.20%（迷迭香酸），說(shuō)明儀器精密度良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品（編號(hào)：S8）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置2、4、6、8、10 h 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果，相似度均為0.90以上。以第11號(hào)峰為對(duì)照峰S，測(cè)定6次色譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積比值的一致性。結(jié)果，RSD 分別為0.15%（阿魏酸）、0.16%（芍藥苷）、0.20%（綠原酸）、0.15%（木犀草苷）、0.21%（3，5-O-雙咖啡酰基奎寧酸）、0.19%（丹酚酸B）、0.11%（丹參酮ⅡA）、0.22%（迷迭香酸），說(shuō)明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品（編號(hào)：S8）適量，共6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果，相似度均為0.90 以上。以第11號(hào)峰為對(duì)照峰S，測(cè)定6次色譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積比值的一致性。結(jié)果，RSD分別為0.15%（阿魏酸）、0.17%（芍藥苷）、0.20%（綠原酸）、0.14%（木犀草苷）、0.20%（3，5-O-雙咖啡?；鼘幩幔?.19%（丹酚酸B）、0.12%（丹參酮ⅡA）、0.23%（迷迭香酸），說(shuō)明本方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.4 樣品指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取10批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將所得的HPLC 圖譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A）》軟件，選擇批號(hào)20131203的藥品為參照?qǐng)D譜，以平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜，時(shí)間窗寬度為0.10 min，對(duì)比色譜圖，確定共有峰為13個(gè)，詳見(jiàn)圖1。以色譜峰穩(wěn)定、重復(fù)性較好的第11號(hào)峰為對(duì)照峰S，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間比值的RSD為0～0.27%，說(shuō)明10 批樣品中13 個(gè)共有峰都能穩(wěn)定出現(xiàn)。而相對(duì)峰面積比值的RSD最高卻達(dá)到60%以上，說(shuō)明各批樣品中13個(gè)共有峰的含量相差較大，故需提高對(duì)該藥品的質(zhì)量控制。對(duì)10 批丹珍頭痛膠囊進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，相似度均大于0.90，詳見(jiàn)表1。

圖1 10批丹珍頭痛膠囊高效液相色譜指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint chromatogram of 10 batches of Danzhen headache capsules

表1 10批丹珍頭痛膠囊的相似度計(jì)算結(jié)果Tab 1 Results of similarity of 10 batches of Danzhen headache capsules

3 討論

3.1 提取方法的選擇

分別對(duì)提取溶劑（甲醇、乙酸乙酯、甲醇-乙酸乙酯、無(wú)水乙醇）、提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）、提取方法（回流、超聲）、料液比（1∶16、1∶20、1∶50、1∶100）、樣品粒度（過(guò)四號(hào)篩、過(guò)七號(hào)篩）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)以甲醇回流、提取時(shí)間2 h、提取料液比1∶16、樣品粒度為過(guò)七號(hào)篩時(shí)，峰的數(shù)量、分離度及峰形均較好。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

在樣品指紋圖譜條件摸索過(guò)程中，分別以甲醇（乙腈）-水、甲醇（乙腈）-0.01%磷酸緩沖液、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-0.01%磷酸緩沖液為流動(dòng)相，且試用不同的梯度，最后確定選擇流動(dòng)相A為水、流動(dòng)相B為甲醇-乙腈（1∶1，V/V）、梯度洗脫時(shí)，各峰分離度較好。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行200～400 nm 全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)340 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)到的峰數(shù)目較多，且分離度較好，故確定340 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 指紋圖譜數(shù)據(jù)分析

10批丹珍頭痛膠囊中13個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積計(jì)算結(jié)果顯示，各共有峰出峰時(shí)間基本穩(wěn)定，但共有峰對(duì)應(yīng)的化合物含量差異較大，可能與藥材的產(chǎn)地、采收期、采收年限、貯藏及生產(chǎn)工藝控制等因素有關(guān)。故需重視藥材來(lái)源，選用優(yōu)質(zhì)藥材，嚴(yán)格控制生產(chǎn)工藝，保證藥品的質(zhì)量。

綜上所述，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于丹珍頭痛膠囊的工藝穩(wěn)定性評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制。

[1]郭桂珍.丹珍頭痛膠囊治療偏頭痛的臨床療效分析[J].中國(guó)社區(qū)醫(yī)師：醫(yī)學(xué)專業(yè)，2010，12（24）：118.

[2]韓強(qiáng).丹珍頭痛膠囊治療血管神經(jīng)性頭痛的臨床觀察[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，5（7）：143.

[3]陳斌，李軍會(huì)，臧鵬，等.六味地黃丸指紋圖譜的近紅外光譜分析方法的建立[J].光譜學(xué)與光譜分析，2010，30（8）：2 124.

[4]單臻，趙陸華，屠穎，等.腎寶片中揮發(fā)油GC指紋圖譜的研究[J].中國(guó)天然藥物，2005，3（3）：158.

[5]向增旭，高山林.HPLC指紋圖譜在金銀花藥材真?zhèn)舞b別中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（9）：996.

[6]魏鳳環(huán)，張佳佳，張璐.夏天無(wú)TLC 指紋圖譜的研究[J].中藥材，2006，29（6）：547.

[7]張辰辰，楊繼章，吳丹，等.香桂化濁膠囊的HPLC-PDA指紋圖譜研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33（1）：86.

[8]曾超，陸東，段偉昌，等.肉桂配方顆粒的HPLC指紋圖譜研究[J].中國(guó)藥房，2014，25（7）：635.

[9]朱文榮，李松.炒牛蒡子配方顆粒的HPLC指紋圖譜研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2014，29（2）：158.

[10]劉悅，龔蘇曉，張鐵軍，等.頭痛滴丸不同提取工藝指紋圖譜比較研究[J].中成藥，2014，36（1）：85.