朱永坤，黃志恩，潘春予，姚 暉#，黎鉆弟，陳 艷（.東莞市第三人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東東莞 56；.佛山市第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東佛山 58000；.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 004）

補(bǔ)陽還五湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，處方為生黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍4.5 g、地龍3 g、桃仁3 g、紅花3 g、川芎3 g，具有益氣、活血、通絡(luò)等作用，可改善腦缺血局部微循環(huán)，減輕腦水腫及氧自由基損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，是治療腦梗死和腦梗死后遺癥的經(jīng)典名方[1-2]。腦卒中是我國的第一大死因，經(jīng)統(tǒng)計(jì)2010年我國就有170萬人死于腦卒中[3]。腦卒中事件中約80%的患者為缺血性卒中患者，主要表現(xiàn)為動(dòng)脈粥樣硬化性和血栓形成，引起管腔狹窄或閉塞后腦部血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死。腦卒中具有高發(fā)病率、高致殘率等特點(diǎn)，治療費(fèi)用高，對患者、患者家庭和社會(huì)均造成沉重的負(fù)擔(dān)。有研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的主要病理基礎(chǔ)，而CD40 和CD40 配體（CD40L）細(xì)胞因子主要參與調(diào)控免疫、炎癥、氧化應(yīng)激、高凝等諸多病生理狀態(tài)，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展和斑塊破裂等環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[4]。本文即采用局灶性腦缺血大鼠模型，研究補(bǔ)陽還五湯對腦缺血模型大鼠血清中CD40和CD40L含量的影響，探討其對急性腦梗死損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

HSS-1 數(shù)字式超級(jí)恒溫浴槽（成都儀器廠）；BP121S 電子天平（德國Sartorius 公司）；醫(yī)用低溫電冰箱（日本Hitachi 公司）；Eclipse Ti熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；MQX200微孔板掃描酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek 公司）；低速控溫離心機(jī)（美國Thermo公司）。

1.2 藥品與試劑

補(bǔ)陽還五湯顆粒劑（廣東一方制藥有限公司，批號(hào)：312506T，規(guī)格：2.0 g ∶10 g）；硫酸氫氯吡格雷片[賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號(hào)：2A183，規(guī)格：每片75 mg]；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（美國Sigma 公司）；10%水合氯醛（上海白鶴化工廠）；大鼠CD40、CD40L酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（美國RB公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

2 方法

2.1 模型的復(fù)制與評價(jià)

采用大腦中動(dòng)脈線栓（MCAO）法[5]復(fù)制大鼠局灶性腦缺血模型。大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）ip 麻醉，仰位固定后，頸正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），并分離迷走神經(jīng)。由CCA分叉處向頭端依次游離，并結(jié)扎右側(cè)CCA近心端、ECA及其所有分支動(dòng)脈，使其主干游離備用。然后分離右側(cè)ICA，沿ICA 向下分離翼腭動(dòng)脈，根部結(jié)扎該分支，僅保留ICA入顱骨主干。在ECA近端備線，用無損傷動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉其遠(yuǎn)端，CCA分叉處做一切口，插入4～0 尼龍線，推進(jìn)17～20 mm 時(shí)可感阻力，表明栓線頭端已經(jīng)通過大腦中動(dòng)脈（MCA）的起始處，阻斷MCA部分血流來源，縫合皮膚，此時(shí)即完成一側(cè)MCAO。假手術(shù)組除不插線外，其余步驟同上。術(shù)后將大鼠置于鋪好清潔墊料的飼養(yǎng)箱內(nèi)自由飲水進(jìn)食。分別于術(shù)后4、8、24 h對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，根據(jù)Zea Longa 的五分制評分標(biāo)準(zhǔn)[5]，最高分為5分。0 分：無神經(jīng)損傷癥狀；0.5 分：豎毛，輕度運(yùn)動(dòng)障礙；1 分：不能伸展對側(cè)前爪，運(yùn)動(dòng)障礙；2分：行動(dòng)不協(xié)調(diào)，屈曲姿勢，旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：痙攣，昏睡，意識(shí)喪失；5分：死亡。分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。當(dāng)評分符合2、3、4 分，并且與正常大鼠存在明顯差異，則可證明模型復(fù)制成功。

2.2 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（生理鹽水）組、模型（生理鹽水）組、陽性對照[硫酸氫氯吡格雷6.75 mg/（kg·d）]組和補(bǔ)陽還五湯高、低劑量[26、6.5 g/（kg·d）]組，每組20 只。各組大鼠按“2.1”項(xiàng)下方法復(fù)制模型，術(shù)后第2 天開始分別按體表面積等效量換算比率計(jì)算人臨床常用劑量的2、0.5倍ig相應(yīng)藥物，給藥體積為10 ml/kg，連續(xù)給藥14 d。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 大鼠的精神狀態(tài)和一般狀況 給藥期間密切觀察各組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況，每周稱體質(zhì)量，記錄神經(jīng)功能評分和體質(zhì)量變化。

2.3.2 大鼠腦組織病理學(xué)變化 取每組大鼠3～4 只，處死后取腦組織以4 ℃冰生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙吸干，先放在10%的中性福爾馬林里泡24 h后制成病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后于Eclipse Ti 熒光倒置顯微鏡下觀察腦組織的病理學(xué)變化。

2.3.3 大鼠血清中CD40 和CD40L 含量 各組大鼠末次給藥后2 h，腹主動(dòng)脈取血約5 ml，3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心30 min，吸取上層血清于－20 ℃下保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法，按試劑盒操作檢測各組大鼠血清中CD40、CD40L含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠神經(jīng)功能評分

術(shù)后4 h，與假手術(shù)組比較，各組大鼠清醒后表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙，提鼠尾可見其左前肢收緊貼胸壁，左側(cè)肢體肌力下降，行走時(shí)偏向左側(cè)，各組大鼠嚴(yán)重程度相似。術(shù)后8、24 h后，大鼠死亡率大大增加。術(shù)后1 d，各組大鼠神經(jīng)功能評分為2～4分，并與正常大鼠存在明顯差異。綜合考慮，每組選取6只大鼠進(jìn)行后續(xù)給藥實(shí)驗(yàn)。

連續(xù)給藥14 d 后，假手術(shù)組、模型組、陽性對照組和補(bǔ)陽還五湯高、低劑量組大鼠的神經(jīng)功能評分分別為0、（0.25±0.53）、（1.6±0.69）、（1.5±0.53）、（2.3±0.48）分。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的神經(jīng)功能評分增加；與模型組比較，陽性對照組和補(bǔ)陽還五湯高、低劑量組大鼠的神經(jīng)功能評分減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3.2 大鼠的一般狀況

模型組大鼠一般狀態(tài)較差，活動(dòng)較少，大多數(shù)體質(zhì)量下降。與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯高劑量組和陽性對照組大鼠上述癥狀有不同程度地改善，體質(zhì)量增加，給藥第7～14 天時(shí)體質(zhì)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。

3.3 大鼠腦組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、血管均形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞密度大，間質(zhì)無水腫；神經(jīng)元胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，無神經(jīng)變性壞死等病理改變。模型組大鼠病灶側(cè)腦組織神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間隙和細(xì)小血管間隙顯著增寬，神經(jīng)細(xì)胞呈空泡樣變，細(xì)胞數(shù)量減少、丟失，皮質(zhì)深層神經(jīng)元胞漿及胞膜形態(tài)不規(guī)則、邊界不清，呈缺血樣病理改變。陽性對照組大鼠病灶側(cè)腦組織神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間隙和細(xì)小血管間隙部分增寬，皮質(zhì)深層神經(jīng)元胞漿及胞膜形態(tài)相對規(guī)則，缺血灶減少。補(bǔ)陽還五湯高劑量組大鼠病灶側(cè)腦組織神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞間隙和細(xì)小血管間隙較顯著增寬，神經(jīng)纖維網(wǎng)呈空泡樣變，但較模型組有改善。補(bǔ)陽還五湯低劑量組大鼠病理改變與模型組相似。各組大鼠腦組織的病理切片圖見圖1。

3.4 大鼠血清中CD40、CD40L含量變化

圖1 各組大鼠腦組織的病理切片圖（HE，×200）Fig 1 Pathological sections of brain tissues of all groups of rats（HE，×200）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中CD40、CD40L 含量均增加；與模型組比較，陽性對照組和補(bǔ)陽還五湯高劑量組大鼠血清中CD40L 含量均減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），其余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠血清中CD40、CD40L含量的測定結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清中CD40、CD40L 含量的測定結(jié)果（，n＝6，ng/ml）Tab 1 Contents of CD40 and CD40L in the serum of all groups of rats（，n＝6，ng/ml）

表1 各組大鼠血清中CD40、CD40L 含量的測定結(jié)果（，n＝6，ng/ml）Tab 1 Contents of CD40 and CD40L in the serum of all groups of rats（，n＝6，ng/ml）

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.sham-operation group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

4 討論

腦缺血后，梗死中心區(qū)的腦細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，釋放自由基和細(xì)胞毒性物質(zhì)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附，介導(dǎo)缺血瀑布反應(yīng)[6-7]。其中在急性腦缺血時(shí)，炎癥反應(yīng)可能對機(jī)體的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后造成不良的影響[8]，在缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展過程中也起著重要的作用。本課題組多年來對補(bǔ)陽還五湯對血小板活化因子（PAF）的體內(nèi)外影響做了大量的研究工作，探討了該方對血小板功能以及PAF代謝、受體活性等的影響，揭示了該方能夠通過降低體內(nèi)PAF含量、抑制PAF受體活性和血小板聚集等作用而抑制血栓形成[9-13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯對腦組織的保護(hù)作用可能與抑制局部炎癥反應(yīng)、降低炎癥因子等水平密切相關(guān)[14-15]。

CD40-CD40L 作為炎性和免疫反應(yīng)中的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)通路，參與調(diào)控免疫、炎癥、高凝等多種病生理狀態(tài)，可激活炎癥反應(yīng)、活化血小板，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙等[16]，在炎癥反應(yīng)中具有重要的調(diào)節(jié)功能。多項(xiàng)研究證實(shí)，CD40-CD40L 系統(tǒng)通路在動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死疾病發(fā)生和發(fā)展的各個(gè)階段均起著重要的作用。其中，CD40L[16-17]（即CD154）是一種Ⅱ型跨膜蛋白（39 kD的跨膜糖蛋白），屬于腫瘤壞死因子α（TNF-α）超家族，主要表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞和血小板。CD40蛋白[17]是一種Ⅰ型跨膜受體，屬于腫瘤壞死因子受體（TNF-R）超家族，在B細(xì)胞膜表面、其他免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞、皮纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血小板上均有表達(dá)。當(dāng)CD40 被CD40L 所激活后即啟動(dòng)炎癥反應(yīng)信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，增加黏附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等表達(dá)[18]。因此，CD40-CD40L 系統(tǒng)通路和腦缺血后炎癥反應(yīng)的關(guān)系密切，針對腦缺血后炎癥反應(yīng)CD40-CD40L系統(tǒng)通路的研究也逐漸成為新藥開發(fā)的研究靶點(diǎn)[16]。血清中CD40L 是由活化血小板膜上脫落后形成的可溶性形式，據(jù)估計(jì)血清中的CD40L 約95%來自血小板[18-19]，其可啟動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞的多種炎癥反應(yīng)。血清CD40L水平的升高是血小板活化和不穩(wěn)定斑塊的標(biāo)志，對心腦血管事件的發(fā)生是一個(gè)有效的、獨(dú)立的預(yù)測指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯對MACO 術(shù)后腦缺血模型大鼠腦組織細(xì)胞有保護(hù)作用，表現(xiàn)為與模型組比較，陽性對照組和補(bǔ)陽還五湯高劑量組血清中CD40L的含量均顯著降低。補(bǔ)陽還五湯高劑量能顯著降低CD40L 含量水平，從而可導(dǎo)致血小板活化水平下降，這與課題組前期發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯能顯著抑制PAF活性結(jié)果相一致。另外，陽性對照組和補(bǔ)陽還五湯高、低劑量組血清中CD40含量與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其原因可能是CD40主要表達(dá)于血小板、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞膜表面，酶聯(lián)免疫吸附所檢測的血清中已除去免疫細(xì)胞和血小板，而血清中存在的CD40含量較低，以致組間差異不大。

綜上，本研究證實(shí)補(bǔ)陽還五湯能改善腦缺血模型大鼠腦組織形態(tài)、減輕腦缺血組織損傷，其機(jī)制可能與降低CD40L含量有關(guān)。

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