金小越，帕提古麗·玉蘇普，王華洋，耿東升（.新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊 83000；.疏附縣人民醫(yī)院藥劑科，新疆喀什 84400；3.新疆軍區(qū)聯勤部藥品儀器檢驗所，烏魯木齊 83000）

蓮威阿那其處方為我院中醫(yī)科治療退行性骨關節(jié)炎、椎間盤突出癥的常用煎劑處方，由雪蓮、阿那其根、肉蓯蓉、桑椹、鹿銜草、透骨草、生白術等12 味藥材組成，具有補骨通絡、活血化瘀、祛風止痛之功效。傳統(tǒng)煎劑煎煮、攜帶、服用不方便，劑型改造是必然趨勢。為此，筆者以多糖含量和粗多糖得率為考察指標[1]，采用正交試驗法優(yōu)選蓮威阿那其處方水提工藝，為該處方的劑型改造提供研究基礎。

1 材料

1.1 儀器

R-200D 型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius 公司）；JYT-5 型架盤分析天平（上海醫(yī)用激光儀器廠）；AKHL-Ⅲ-16型艾柯超純水機（四川成都康寧實驗專用純水設備廠）；UV-240 型紫外-可見分光光度儀（日本Shimadzu 公司）；W-201B型數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；ZKG4080 型高溫真空干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）。

1.2 藥材

雪蓮（批號：120112）、阿那其根（批號：110918）、肉蓯蓉、桑椹、鹿銜草、透骨草、生白術（批號均為：120119）等12味藥材購于新疆本草堂中藥飲片有限公司，由新疆醫(yī)科大學第六附屬醫(yī)院提供藥材質檢報告書，藥材符合2010 年版《中國藥典》（一部）相關藥材項下的規(guī)定[2]，其中雪蓮、阿那其根符合《維吾爾藥志》相關藥材項下的規(guī)定[3-4]。

1.3 藥品與試劑

D（+）-無水葡萄糖對照品（簡稱葡萄糖對照品，四川省維克奇生物科技有限公司，批號：110728，純度：98%）；95%乙醇、濃硫酸、苯酚均為國產分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 水提工藝方法及指標評分公式

將晾干后的醇提藥材（雪蓮、肉蓯蓉、威靈仙、仙靈脾、雞血藤）的藥渣與剪碎成綠豆大小的阿那其根、桑椹、鹿銜草、透骨草（水提藥材）以及生白術揮發(fā)油提取后晾干的藥渣混勻，沸水投料，以多糖含量和粗多糖得率的綜合評分為指標，進行單因素及正交試驗，篩選最優(yōu)水提取工藝。依據藥材中活性成分的藥理作用及所占比重，設定多糖含量和粗多糖得率的評分權重系數分別為0.8、0.2，評分公式為：多糖含量評分＝多糖含量/最大多糖含量×80；粗多糖得率評分＝粗多糖得率/最大粗多糖得率×20；綜合評分＝多糖含量評分+粗多糖得率評分。

2.2 粗多糖的提取及得率測定[5]

將剪碎成綠豆大小的阿那其根、桑椹、鹿銜草、透骨草和乙醇回流提取后的雪蓮等5 味藥材的藥渣以及生白術提取揮發(fā)油后的干藥渣合并沸水投料進行水煎煮提取，過濾后，將藥液濃縮為每1 ml 藥液約含生藥0.2 g。放至室溫后，在快速攪拌下迅速加入95%乙醇，使藥液含醇量達到80%，室溫放置1 h 后，密封于4 ℃冰箱，冷藏24 h，過濾，濾渣用95%乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌多次，即可得到粗多糖。再經干燥6 h，及時移至干燥器中，冷卻30 min 后，精密稱定質量，計算粗多糖得率：

粗多糖得率＝粗多糖樣品質量/提取多糖藥材的質量×100%

2.3 水提液中多糖含量測定方法的研究[6]

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取于105 ℃烘箱干燥至恒質量的葡萄糖對照品25.00 mg，置于25 ml 量瓶中，超純水超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1.00 mg/ml的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥后粗多糖粉末5.00 mg，加至50 ml量瓶中，加超純水超聲溶解并加至刻度，搖勻。

2.3.3 多糖含量測定波長的確定 采用苯酚-硫酸法測定[7]。精密量取對照品和供試品溶液各1.0 ml，置于50 ml錐形瓶中，分別精密加入1.6 ml 新制備的5%苯酚溶液，震蕩搖勻后，迅速精密加入濃硫酸6.0 ml，充分振蕩搖勻，室溫放置25 min。以超純水平行試驗為空白參比，在400～700 nm 波長下用紫外-可見分光光度計進行掃描，詳見圖1。

結果表明，供試品溶液與對照品溶液均在485 nm 波長處有最大吸收峰，故確定485 nm為多糖含量測定波長。

圖1 紫外掃描光譜圖1.對照品；2.供試品Fig 1 UV scanning spectrum1.reference substance；2.test sample

2.3.4 線性范圍考察 分別精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml的葡萄糖對照品溶液，置于10 ml量瓶中，超純水定容至刻度，充分搖勻，制備成系列質量濃度的對照品溶液。精密量取對照品溶液各1.0 ml，置于50 ml錐形瓶中，分別精密加入1.6 ml新制備的5%苯酚溶液，振蕩搖勻后，迅速精密加入濃硫酸6.0 ml，充分振蕩搖勻，室溫放置25 min。以超純水平行試驗為空白參比，在485 nm 波長處測定吸光度。以葡萄糖對照品吸光度（A）對質量濃度（c）進行回歸，得回歸方程A＝8.230c－0.017（r＝0.999 7），結果表明，葡萄糖檢測質量濃度線性范圍為0.02～0.1 mg/ml。

2.3.5 精密度試驗 精密量取0.06 g/L 對照品溶液6 份，每份1.0 ml，按照“2.3.4”項下方法加入顯色劑進行操作，以超純水平行試驗為空白參比，結果吸光度的RSD為0.29%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.6 重復性試驗 準確稱取6 批水提藥材干燥后的粗多糖粉末5.00 mg，共6 份，置于50 ml 量瓶中，依法測定，結果含量的RSD為1.09%（n＝6），表明方法重復性較好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 分別準確量取對照品和供試品溶液（0.06 mg/ml）各1.0 ml，分別于1、2、3、4、5、24 h 時加入顯色劑進行操作，測定吸光度，計算含量。結果含量的RSD 分別為1.71%、1.73%（n＝6），表明對照品溶液、供試品溶液放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批干燥后粗多糖粉末5.00 mg，各9份，加入至50 ml量瓶中，再分別精密加入1.84、2.30、2.76 mg 葡萄糖對照品，加超純水超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。各精密量取1 ml，加入顯色劑進行操作，計算回收率。結果平均回收率為99.38%（RSD＝0.96%，n＝3）。

2.3.9 樣品含量測定 精密稱取3 批蓮威阿那其水提處方藥材，按“2.2”項下方法得到多糖，并按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，測定吸光度，計算即得。

2.4 提取工藝的優(yōu)選[8]

2.4.1 單因素試驗 正交試驗前，首先對其影響因素進行單因素試驗，考察了不同加水倍量、提取時間、提取次數對多糖含量和粗多糖得率水提工藝的影響，最后確定以評分較高的各因素水平（加水倍量12、16、20倍，提取時間1.0、1.5、2.0 h，提取次數1、2、3次）進行正交試驗。

2.4.2 正交試驗設計與結果 選擇水為提取溶劑，以加水倍量（A）、提取時間（B）和提取次數（C）為考察因素，每個因素選取3 個水平，以多糖含量和粗多糖得率綜合評分作為評價指標，采用L9（34）正交表進行試驗。因素與水平見表1；正交試驗安排與結果見表2；方差分析結果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗安排與結果Tab 2 Arrangement and results of orthogonal experiment

表3 方差分析結果Tab 3 Analysis results of variance

由表2、表3結果可知，各因素對提取效果影響的大小順序為提取次數（C）＞提取時間（B）＞加水倍量（A），故優(yōu)選的提取工藝是A3B3C3。根據正交試驗結果，加水倍量（A）因素的影響較小。考慮到節(jié)約成本、保護水資源，故最后確定優(yōu)選工藝條件為A1B3C3，即加入12倍量的水，提取時間2.0 h，提取3次。

2.4.3 驗證試驗 取處方量水提藥材，依照優(yōu)化提取條件，平行提取3份樣品，測定多糖含量及粗多糖得率。結果多糖含量分別為36.41、36.37、36.24 μg/ml，平均值為36.34 μg/ml（RSD＝0.24%，n＝3）；粗多糖得率分別為10.13%、10.26%、10.17%，平均值為10.18%（RSD＝0.65%，n＝3），表明優(yōu)選的水提工藝穩(wěn)定、合理、可行。

3 討論

3.1 處方采用水提取工藝的理論基礎

蓮威阿那其處方在臨床應用是中藥煎劑，療效確切。鑒于傳統(tǒng)煎劑的缺點，筆者對其劑型進行了改造。根據原劑型的特點，水提物是發(fā)揮療效的主要成分，同時兼顧了處方各藥材所含成分的理化性質及功能主治的相關性。天山雪蓮含有蘆丁、槲皮素、高車前素、柯伊利素、木犀草素等黃酮類，大苞雪蓮內酯等內酯類以及多糖[9]類等化學成分；肉蓯蓉主要含有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、單糖、雙糖、多糖、氨基酸等[10]；桑椹的主要活性物質包括花色苷、白藜蘆醇、蘆丁、多糖[11]等以及人體所必需的18 種氨基酸，其中多糖存在于多種藥材中，故筆者選取多糖含量及粗多糖得率為評價指標。

3.2 指標在綜合評分中的權重分配

蓮威阿那其處方是由12 味藥組成的復方制劑，采用提純的單個指標或活性成分難以全面反映提取工藝的優(yōu)劣。本處方的雪蓮、肉蓯蓉、桑椹等都含有多糖，是該處方中主要藥理活性成分之一，故試驗設計多糖含量權重比例為0.8。同時，結合復方制劑的特點，采用粗多糖得率為輔助指標，兼顧單一與復合成分，并根據相對貢獻分配權重，設粗多糖得率權重比例為0.2。因此，筆者認為，本試驗設定的質控指標依據了臨床的有效性及功能主治，使處方質量控制更貼近臨床應用。

本試驗的水提工藝主要是對處方藥材的水提浸膏工藝的優(yōu)化，同時驗證了定量指標的可行性，使處方的制劑質量控制和臨床應用均有可控性。

[1]王華洋，耿東升.蓮威阿那其處方水提浸膏中總糖含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（5）：47.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：95、126、180、281、304、306.

[3]劉勇民.維吾爾藥志：上[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：433.

[4]劉勇民.維吾爾藥志：下[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：499.

[5]楊永東，李聰穎，唐策，等.藏藥蔓菁抗氧化活性多糖的提取及純化工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（7）：7.

[6]李計萍.中藥新藥研究中多糖含量測定方法探討[J].中國中藥雜志，2014，39（17）：3 392.

[7]林穎，吳毓敏，吳雯，等.天然產物中的糖含量測定方法正確性的研究[J].天然產物研究與開發(fā)，1996，8（3）：5.

[8]江尚飛，劉應杰，楊宗發(fā)，等.正交試驗優(yōu)選遼源七厘復方中藥提取工藝[J].中國藥房，2014，25（27）：2 521.

[9]瞿科峰，王聰，高貴珍，等.天山雪蓮的研究進展[J].湖北農業(yè)科學，2009，48（11）：2 869.

[10]李媛.肉蓯蓉的化學成分及藥理作用研究進展[J].中國野生植物資源，2010，29（1）：7.

[11]陳誠，李洪波，楊欣，等.中藥桑椹活性物質的研究進展[J].中藥材，2010，33（10）：1 660.