陶志鵬，張凌晶，翁　　凌，劉光明，曹敏杰

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省水產(chǎn)品深加工工程研究中心,福建 廈門 361021)

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鮑魚肌原纖維結(jié)合型蛋白酶的初步鑒定

陶志鵬1,2，張凌晶1,2，翁凌1,2，劉光明1,2，曹敏杰1,2

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省水產(chǎn)品深加工工程研究中心,福建 廈門 361021)

[摘要]研究了皺紋盤鮑腹足肌肉中肌原纖維結(jié)合型蛋白酶對肌原纖維蛋白的降解作用.SDS-PAGE結(jié)果顯示，肌原纖維在55~60 ℃下，肌球蛋白重鏈(Myosin Heavy Chain,MHC)和副肌球蛋白(Paramyosin,PM)會發(fā)生明顯的降解.金屬蛋白酶抑制劑EDTA、1，10-phenathroline能夠有效抑制MHC和PM的分解.EDTA以及絲氨酸蛋白酶抑制劑benzamidine共同作用幾乎可完全抑制蛋白質(zhì)降解，揭示鮑魚肌肉中存在肌原纖維結(jié)合型金屬蛋白酶(Metalloproteinase,MP)和絲氨酸蛋白酶 (Serine proteinase,SP).通過加熱、強(qiáng)離子濃度溶液抽提相結(jié)合的方式，從肌原纖維蛋白中初步分離出這兩種酶.分別利用這兩種酶對肌原纖維蛋白進(jìn)行降解，發(fā)現(xiàn)最適溫度均在60 ℃左右，與肌原纖維蛋白自身降解的最適溫度(55~60 ℃)相吻合.對SP的底物特異性分析結(jié)果表明，制備的絲氨酸蛋白酶對P1位為Arg殘基的熒光底物有較高的分解作用，而對P1位為Lys殘基的底物分解較弱.

[關(guān)鍵詞]鮑魚；肌原纖維； 降解；金屬蛋白酶；絲氨酸蛋白酶

0引言

鮑魚屬軟體動物門、腹足綱、前腮亞綱、原始腹足目、鮑科、鮑屬，以其較高的營養(yǎng)價值和藥學(xué)價值而位列“海產(chǎn)八珍”之一[1].迄今為止，全世界各海區(qū)已命名的鮑魚有216種，常見種類約有30種，在我國沿海分布主要有7種，比較重要的經(jīng)濟(jì)種類約有3個：皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)、雜色鮑(Haliotis diversicolor)和九孔鮑(Haliotis diversicolor supertexta).隨著經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展，人們對高品質(zhì)食品需求的增加，鮑魚以其濃厚的傳統(tǒng)文化背景、獨特的風(fēng)味口感和較高的營養(yǎng)價值，越來越受到大眾的青睞.需求的增加帶動了鮑魚養(yǎng)殖、加工產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展.據(jù)統(tǒng)計，2012年我國鮑魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)到9.1萬t，較2011年增長18.1%，而當(dāng)年福建省的鮑魚產(chǎn)量達(dá)到6.5萬t[2].皺紋盤鮑為我國北部沿海最主要的漁獲種類，也是該地區(qū)最優(yōu)良的淺海增養(yǎng)殖貝類之一.由于福建等南方海域冬季水溫較高，適合鮑魚生長，并且隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)的進(jìn)步，皺紋盤鮑的“北鮑南養(yǎng)”養(yǎng)殖方式得到廣泛的實施，這不僅提高了鮑魚的成活率，也降低了養(yǎng)殖成本.目前，鮑魚加工產(chǎn)品主要有罐頭、干制品和冷凍品.鮑魚肌肉中的蛋白質(zhì)主要包括肌原纖維蛋白和膠原蛋白，其中，膠原蛋白與肌原纖維蛋白緊密結(jié)合，使得鮑魚肌肉具有緊致的結(jié)構(gòu)和良好的咀嚼性.研究發(fā)現(xiàn)，軟體類動物如魷魚肌肉中存在活力較強(qiáng)的酶類，能夠降解穩(wěn)定性較好的副肌球蛋白[3].研究者已從魷魚肌肉中純化出能夠降解肌球蛋白重鏈的金屬蛋白酶[4].同樣，鮑魚在熱加工過程中，肌肉蛋白會發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而對鮑魚最終制品的質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生影響[5].通過電泳及透射式掃描電鏡觀察鮑魚在熱加工過程中蛋白質(zhì)的變化情況，發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白在受熱條件下會發(fā)生降解，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著破壞[6].

迄今為止，國內(nèi)外對引起魚類肌原纖維蛋白降解的酶類及其內(nèi)源性抑制劑研究較多[7- 10].然而，對鮑魚等貝類水產(chǎn)品在熱加工過程中肌原纖維蛋白的降解，以及引起這一現(xiàn)象的酶類的研究，報道甚少.本文旨在研究引起鮑魚肌原纖維蛋白降解的蛋白酶類，探討它們的理化性質(zhì)，揭示熱加工過程中這些酶類對蛋白質(zhì)的影響，為鮑魚加工提供一定的理論參考.

1材料與方法

1.1　材料與儀器

鮮活皺紋盤鮑(質(zhì)量80~90 g/只)購于福建省廈門市高崎水產(chǎn)品批發(fā)市場，即殺后去內(nèi)臟取肌肉放置于冰上，備用；各種熒光合成底物購于日本Peptide Institute公司；蛋白酶抑制劑1,10-phenathroline，benzamidine，Pefabloc SC， Aprotinin購于美國Sigma公司；E64，Leupeptin購自德國Roche公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量購于美國Bio-Rad公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

Avanti J-26S XP 高速冷凍離心機(jī)(Beckman,美國)；Lamda 35型紫外可見分光光度計(Perkin Elmer，美國)；FP-6200熒光分光光度計 (Jasco,日本)；G:Box 凝膠成像儀 (Syngene,英國)；組織搗碎機(jī)(Kinematica，瑞士)；WB-14恒溫水浴鍋(Memmert，德國)；蛋白質(zhì)電泳裝置(Bio-Rad，美國).

1.2　實驗方法

1.2.1絲氨酸蛋白酶活力測定

絲氨酸蛋白酶活力測定方法主要參考Guo等[8]的方法并作適當(dāng)修改.以 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 為熒光底物，在850 μL 50 mmol/L Tris-HCl (pH= 8.0) 緩沖液中，分別加入100 μL 適量的酶液，50 μL熒光底物在55 ℃孵育30 min，立即加入1.5 mL終止液(V(甲醇)∶V(異丙醇)∶V(水)=35∶30∶35)終止反應(yīng)，用熒光分光光度計在激發(fā)光波長為380 nm 和發(fā)射光波長為450 nm下測定反應(yīng)釋放出的7-氨基-4-甲基香豆素 (7-amino-4-methycoumarin，AMC) 的含量.酶活力單位定義為每分鐘內(nèi)分解熒光底物釋放出1 nmol AMC 為1個單位.

1.2.2鮑魚肌肉肌原纖維蛋白的制備

肌原纖維蛋白提取主要參考Cao等[9]從狗母魚中制備肌原纖維蛋白的方法.新鮮的鮑魚腹足肌肉用刀切成小塊剁碎后與4 倍體積的20 mmol/L Tris-HCl(pH= 8.0)緩沖液一起經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎.搗碎后的勻漿液在 4 ℃下8000 r/min 離心15 min，棄除上清液，將下層沉淀取出用上述緩沖液攪勻，組織勻漿后，在4 ℃ 下8000 r/min離心15 min，取出沉淀.再重復(fù)以上步驟3次，將最后得到的沉淀取出并溶解于含有0.5 mol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)緩沖液中，即為鮑魚肌肉肌原纖維蛋白.制備的肌原纖維蛋白立即使用或凍存于-70 ℃ 冰箱中備用.

1.2.3滅活肌原纖維蛋白的制備

為消除內(nèi)源性金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的影響，在制備好的鮑魚肌原纖維蛋白中加入5 mmol/L EDTA、10 mmol/L benzamidine 和1 mmol/L Leupeptin終濃度，充分混合，4 ℃ 靜置2 h，然后用9000 r/min離心20 min，將所得沉淀與4倍體積蒸餾水混勻攪拌，離心.重復(fù)洗滌4次，將最后所得沉淀溶解于含0.5 mol/L NaCl 的20 mmol/L Tris-HCl(pH =8.0)緩沖液中.

1.2.4鮑魚肌原纖維蛋白在不同溫度下的自身降解

取肌原纖維100 μL 置于0.5 mL Eppendorf 管中，分別在30、40、50、55、60、70 ℃下加熱2 h.加熱完成后，樣品經(jīng)SDS化后，95 ℃加熱10 min后，上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%~20%梯度的SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，電泳膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后分析蛋白質(zhì)的降解情況.

1.2.5各種蛋白酶抑制劑對肌原纖維蛋白降解的抑制作用

取肌原纖維100 μL置于0.5 mL的Eppendorf 管中，加入蛋白酶抑制劑至不同終濃度，在室溫下反應(yīng)30 min后轉(zhuǎn)入55 ℃恒溫水浴繼續(xù)反應(yīng)2 h.蛋白酶抑制劑包括：金屬蛋白酶抑制劑(EDTA，1,10-phenathroline)，絲氨酸蛋白酶抑制劑(benzamidine，Pefabloc SC，Aprotinin),半胱氨酸蛋白酶抑制劑(E-64，Leupeptin).樣品經(jīng)SDS化后上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%~20%梯度的SDS-PAGE.電泳結(jié)束后，將膠以考馬斯亮藍(lán)染色，分析各種抑制劑對由結(jié)合型蛋白酶引起的肌原纖維蛋白降解的抑制效果，從而判斷蛋白酶的性質(zhì).

1.2.6結(jié)合型蛋白酶的解離

重復(fù)鮑魚肌肉肌原纖維蛋白提取過程中的洗滌步驟，將最后的沉淀與含0.5 mol/L KCl，1 mmol/L MgCl2的20 mmol/L Tris-HCl(pH= 8.0)緩沖液混勻，經(jīng)組織搗碎后，勻漿液立即置于沸水浴中，不斷攪拌直至中心溫度達(dá)到45,50，55,60 ℃，然后置于不同溫度的恒溫水浴中繼續(xù)加熱1~30 min后，將樣品在9000 r/min 下離心20 min，所得上清液即為粗酶液，用于酶活力測定.

1.2.7結(jié)合型蛋白酶對滅活肌原纖維蛋白降解的比較

在以上解離得到的酶液中加入終濃度為5 mmol/L的EDTA作為絲氨酸蛋白酶(SP)粗酶液；在酶中加入終濃度為5 mmol/L benzamidine和1 mmol/L Leupeptin 作為金屬蛋白酶(MP)粗酶液.分別將50 μL SP和MP加入到100 μL肌原纖維蛋白中，在30、40、50、55、60、70 ℃恒溫水浴下加熱2 h.樣品經(jīng)SDS化后上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%~20%梯度的SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，將膠以考馬斯亮藍(lán)染色，分析兩種酶對肌原纖維蛋白降解的最適溫度以及降解強(qiáng)度.

1.2.8SP底物特異性分析

以不同類型的熒光底物為目標(biāo)分解物，不改變酶活力測定的其他條件，測定相應(yīng)的酶活力.將底物 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 活性作為100%，其他底物活性換算成相應(yīng)的百分?jǐn)?shù).

2結(jié)果與討論

2.1　肌原纖維蛋白降解的最適溫度

鮑魚肌肉在反復(fù)清洗去除可溶性蛋白質(zhì)中所含的水溶性蛋白酶之后，仍然存在肌球蛋白重鏈(MHC)和副肌球蛋白(PM)降解的現(xiàn)象，結(jié)果見圖1.表明在鮑魚肌原纖維蛋白中存在與肌原纖維蛋白結(jié)合的酶類，該酶能夠?qū)≡w維蛋白產(chǎn)生明顯的降解.在較低溫度(30 ℃)和較高溫度(70 ℃)條件下，肌原纖維蛋白降解不明顯，而在55~60 ℃條件下降解最為顯著，表明該酶最適溫度為55~60 ℃.當(dāng)在55 ℃下反應(yīng)2 h后，MHC 幾乎完全降解，PM大部分被降解，而肌動蛋白(Actin)沒有明顯的變化.有研究表明，在加熱過程中鮑魚肌原纖維蛋白的提取率會降低[5]，主要是由于軟體動物特有的副肌球蛋白(PM)會發(fā)生熱聚集，肌肉硬度、彈性等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)均發(fā)生不利于產(chǎn)品質(zhì)量的變化[6].日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)軟體動物魷魚在熱加工過程中，類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶對肌原纖蛋白降解是導(dǎo)致魷魚品質(zhì)下降的主要原因[3].西班牙學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)能夠有效抑制魷魚熱加工過程中粘性和彈性等質(zhì)量指標(biāo)下降[11].這些結(jié)果提示，軟體動物中存在與肌原纖維蛋白降解密切相關(guān)的絲氨酸蛋白酶.

2.2　不同抑制劑對肌原纖維蛋白降解的影響

為了進(jìn)一步明確引起肌原纖維蛋白降解的酶的種類，在肌原纖維蛋白中加入了不同酶類的抑制劑，考察它們對肌原纖維蛋白降解的抑制效果，結(jié)果如圖2a所示.由圖2a可見，金屬蛋白酶抑制劑(EDTA、1，10-phenathroline)對肌原纖維蛋白自身降解抑制效果較為明顯，絲氨酸蛋白酶抑制劑(benzamidine、Aprotinin)對MHC的降解有一定的抑制效果，但Pefabloc SC的抑制效果不明顯，半胱氨酸蛋白酶抑制劑(E64，Leupeptin)則沒有抑制效果.同時添加金屬蛋白酶抑制劑EDTA和絲氨酸蛋白酶抑制劑benzamidine，能夠完全抑制肌原纖維蛋白的降解(見圖2b).以上結(jié)果表明，在鮑魚肌原纖維蛋白中同時存在能夠降解肌原纖維蛋白的金屬蛋白酶(MP)和絲氨酸蛋白酶(SP).

2.3　結(jié)合型蛋白酶的解離

以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，測定解離得到的絲氨酸蛋白酶活力為指標(biāo)，判斷解離效果，結(jié)果如圖3所示，可見，在60 ℃加熱5 min，解離效果最好.然而，在45~55 ℃條件下，加熱不同時間，都不能很好地將絲氨酸蛋白酶從肌原纖維蛋白中解離出來.原因可能是溫度低時，肌原纖維蛋白的變性程度較低，使得肌原纖維結(jié)合型蛋白酶不能從肌原纖維中解離出來.當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時，肌原纖維蛋白的變性程度提高，同時，蛋白酶在該溫度下對肌原纖維蛋白產(chǎn)生強(qiáng)烈降解，使酶從肌原纖維蛋白中解離出來.但在60 ℃下，解離時間超過5 min后，絲氨酸蛋白酶活力會降低，可能是由于加熱時間過長，蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致酶液失活.研究報道，淡水魚和小鼠肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶(MBSP)主要通過離子鍵和肌原纖維蛋白結(jié)合，可以通過增加離子強(qiáng)度將MBSP從肌原纖維蛋白中抽提出來[7,12].然而，對海水魚如狗母魚(Saurida wanieso)和白姑魚(Pennahia argentata)的MBSP，利用類似的方法則不能將它們解離出來.通過對肌原纖維蛋白進(jìn)行短暫的加熱處理，成功從狗母魚肌原纖維中抽提出MBSP[9].因此，推測海水魚MBSP 和肌原纖維蛋白以其他的作用力方式結(jié)合在一起.本研究中，單獨采用加熱抽提或強(qiáng)離子濃度緩沖液抽提均未成功提取MBSP(結(jié)果未給出)，而將兩種方法結(jié)合則獲得成功.因此，推測在鮑魚肌肉中，SP和肌原纖維蛋白的結(jié)合除離子鍵外還存在其他的作用力.

2.4　MP和 SP 對肌原纖維蛋白降解效果的比較

利用制備的MP和SP粗酶對鮑魚肌原纖維蛋白的分解作用進(jìn)行研究，結(jié)果見圖4.從圖4可以看出，MP和SP均在40 ℃開始降解肌原纖維蛋白，它們的最適溫度都在60 ℃左右.在60 ℃反應(yīng)2 h后，MP能夠完全降解MHC，PM也大量被降解(圖4a).添加SP組，MHC有部分降解，PM降解則很微弱，但在60 ℃和70 ℃下可發(fā)現(xiàn)有分子質(zhì)量為60 ku左右的分解產(chǎn)物，但不確定是否來源于MHC或PM(圖4b).表明在肌原纖維蛋白降解過程中，MP發(fā)揮的作用比SP要顯著.

對魚類肌原纖維蛋白自身降解酶類的研究，主要集中在MBSP[9,13].金屬蛋白酶是一類金屬離子依賴型的內(nèi)肽酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白和非膠原蛋白成分[14].對海水鯛魚(Pagrus major)、淡水鯉魚(Cyprinus carpio)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)等的研究報道證實，金屬蛋白酶通過降解膠原蛋白導(dǎo)致魚肉軟化[15-17].然而，關(guān)于水產(chǎn)動物金屬蛋白酶對肌原纖維蛋白降解的研究甚少.日本學(xué)者從魷魚肌肉中純化出兩種能夠降解MHC的金屬蛋白酶，并通過N-端測序的方法研究了這兩種酶對MHC的特異性酶切位點[4].結(jié)果表明，降解MHC的兩種金屬蛋白酶酶切位點存在差異，Myosinase I酶切位點主要在Ala-1161和Thr-1162，而Myosinase II酶切位點主要在Glu-1381和Thr-1382之間.因此推測，兩種金屬蛋白酶在對肌原纖維蛋白的降解過程中，先后發(fā)揮著不同的作用，共同對其進(jìn)行分解.

2.5　SP的底物特異性

對解離后制備的絲氨酸蛋白酶的底物特異性研究表明，SP對P1位為Arg的底物有較高的分解作用，對P1和P2位含有兩個Arg的熒光底物酶切活性更高，而對P1位為Lys的底物活性較低.對半胱氨酸蛋白酶底物Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA則沒有分解(見表1).這與從狗母魚中純化的MBSP類似[9]，表明制備的酶為一種肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶.

表1 SP的底物特異性Tab.1 SubstratespecificityofSP熒光底物Fluoresccentsubstrate相對活力Relativeactivity/%Boc-Phe-Ser-Arg-MCA100.0±4.6Boc-Gln-Arg-Arg-MCA113.1±4.1Boc-Val-Pro-Arg-MCA68.7±2.3Boc-Val-Leu-Lys-MCA68.5±3.8Boc-Leu-Lys-Arg-MCA62.4±2.6Boc-Glu-Lys-Lys-MCA15.0±2.4Z-Phe-Arg-MCA0Z-Arg-Arg-MCA0

3結(jié)論

鮑魚肌原纖維蛋白在60 ℃能夠發(fā)生明顯的降解，蛋白酶抑制劑對降解的抑制效果證明，引起肌原纖維蛋白降解的酶類主要是金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶.通過加熱、強(qiáng)離子溶液抽提相結(jié)合的方式，從鮑魚肌原纖維中初步分離了金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶.這兩種酶對肌原纖維蛋白的最適降解溫度均在60 ℃左右.SDS-PAGE結(jié)果顯示，在降解肌原纖維蛋白過程中，金屬蛋白酶的活力高于絲氨酸蛋白酶.絲氨酸蛋白酶的底物特異性表明，該酶類似于海水魚MBSP.

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(責(zé)任編輯馬建華英文審校曹敏杰)

Characterization of Myofibril-bound Proteinasesfrom the Muscle of AbaloneTAO Zhi-peng1,2,ZHANG Ling-jing1,2,WENG Ling1,2,LIU Guang-ming1,2,CAO Min-jie1,2

(1.College of Food and Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;

2.Engineering Research Center for High Utilization of Aquatic Products,Xiamen 361021,China)

Abstract：The effect of myofibril-bound proteinases on the degradation of myofibrillar proteins of abalone(Haliotis discus hannai) was studied.Myosin heavy chain (MHC) and paramyosin (PM) degraded obviously at 55~60 ℃ as indicated on SDS-PAGE,suggesting the existence of myofibril-bound proteinases in abalone muscle.Metalloproteinase inhibitors (EDTA,1,10-phenathroline)effectively inhibited the degradation of MHC and PM.EDTA together with serine proteinase inhibitor benzamidine could completely suppress the degradation of MHC and PM,indicating the existence of metalloproteinase (MP) and serine proteinase (SP) in myofibrillar proteins.By heating treatment together with high ion concentration buffer treatment,MP and SP were extracted from myofibrillar proteins and both effectively degraded MHC and PM at optimal temperature of 60 ℃.Substrate specificity analysis of SP indicated that it hydrolyzed substrates containing arginine residue at P1 while those with lysine residue at P1 were slightly hydrolyzed.

Key words:abalone;myofibrillar proteins;degradation;metalloproteinase;serine proteinase

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[中圖分類號]TS 254.1

[文章編號]1007-7405(2015)02-0098-07

[作者簡介]陶志鵬(1989—)，男，碩士生，從事食品生物化學(xué)研究.通訊作者：曹敏杰(1964—)，男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)化學(xué)及生物技術(shù)研究，E-mail:mjcao@jmu.edu.cn.

[基金項目]十二五國家科技支撐計劃項目(2012BAD38B09)；國家自然科學(xué)基金資助項目(31271838)

[收稿日期]2014-03-21[修回日期]2014-04-14