岳 磊，張 垚，馬 卓

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150080)

激光掃描共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)技術(shù)與應(yīng)用

岳 磊，張 垚，馬 卓

(哈爾濱工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150080)

介紹了激光掃描共聚焦顯微鏡的工作原理、常規(guī)樣品制備要求，以及圖像獲取的基本方法，包括光路設(shè)置及光強(qiáng)度調(diào)節(jié)、針孔的調(diào)節(jié)、增益值的調(diào)節(jié)、透射光路及DIC設(shè)置等.在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步介紹了共聚焦在生物學(xué)研究領(lǐng)域上的應(yīng)用技巧，如多通道熒光采集、多層掃描及三維構(gòu)建、熒光共定位及強(qiáng)度分析、時(shí)間序列掃描及光漂白技術(shù)，為快速掌握共聚焦的操作技巧提供有力的技術(shù)參考.

激光掃描共聚焦顯微鏡；圖像；應(yīng)用

激光掃描共聚焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品，是當(dāng)今分子生物學(xué)和生命科學(xué)重要的分析儀器之一[1].它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細(xì)胞水平上觀察諸多生理信號(hào)機(jī)細(xì)胞形態(tài)的變化，成為形態(tài)學(xué)、分子細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、藥理學(xué)、遺傳學(xué)等科學(xué)領(lǐng)域中強(qiáng)有力的研究工具[2].如何運(yùn)用共聚焦拍攝出清晰的信號(hào)圖像，對(duì)于一些初次接觸共聚焦的科研人員會(huì)有些無(wú)從入手，本文通過(guò)介紹共聚焦的操作技巧以及在生物學(xué)上的應(yīng)用技術(shù)，對(duì)初學(xué)人員提供快速有效的應(yīng)用參考.

1 儀器介紹

儀器型號(hào)：Zeiss LSCM510

主要技術(shù)參數(shù)：4種激光器：He-Ne 激光器 激發(fā)波長(zhǎng)633 nm；He-Ne 激光器 激發(fā)波長(zhǎng)543 nm；Ar多線激光器 激發(fā)波長(zhǎng)458/488/514 nm；Diode 固體激光器 激發(fā)波長(zhǎng)405 nm.5種可選物鏡：10X，20X，40Xoil，63Xoil，100Xoil，每個(gè)物鏡都有Plus-DIC功能.

2 基本原理

Confocal 利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，來(lái)自光源的光通過(guò)照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋[3-4].照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測(cè)點(diǎn)所在的平面即共焦平面.計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像.只要載物臺(tái)沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像[5].

3 常規(guī)樣品制備要求

3.1 染料的選擇

由于共聚焦是以單一波長(zhǎng)的激光作為光源，因此在選擇熒光染料時(shí)要根據(jù)儀器配備的激光器波長(zhǎng)選擇，如果在同一樣品中有多種熒光染料標(biāo)記，還要考慮它們的發(fā)射波長(zhǎng)盡量不要重疊，避免串色問(wèn)題[6].

3.2 樣品承載物的選擇

一般的共聚焦高倍物鏡均為油鏡，它的數(shù)值孔徑較小，要求鏡頭與樣品之間的工作距離不大于0.17 mm，因此如果觀察樣品為貼壁細(xì)胞或組織切片，可以用普通的載玻片和蓋玻片即可.如果是懸浮細(xì)胞或懸浮粒子，可以用共聚焦專(zhuān)用的培養(yǎng)皿(glass bottom)承載樣品進(jìn)行觀察[7].

3.3 封片劑的選擇

如果樣品只需要觀測(cè)一次并且不是極易淬滅的熒光，可以選用一定濃度的甘油混合液封片即可.如果樣品需要放置一段時(shí)間并多次拍攝，應(yīng)選用抗熒光淬滅的封片劑，以減少熒光信號(hào)丟失[8].

4 圖像獲取的基本方法

4.1 光路設(shè)置及光強(qiáng)度調(diào)節(jié)

根據(jù)樣品結(jié)合的熒光探針?lè)N類(lèi)來(lái)選擇相應(yīng)的激光器(即發(fā)射波長(zhǎng))，如果樣品為多種熒光染色，建議使用Multi Track模式進(jìn)行信號(hào)采集，以避免串色問(wèn)題.有些熒光染料發(fā)射波段比較寬，當(dāng)與其他染料在同一樣品中時(shí)，多通道采集也會(huì)串色，這時(shí)可以考慮將發(fā)射波段的濾片由長(zhǎng)通(LP)調(diào)整為帶通(BP)，或者進(jìn)一步選用特征光譜曲線(Spectra)進(jìn)行掃描[9].

激光強(qiáng)度越高，樣品的信號(hào)越強(qiáng)，但熒光也容易淬滅或漂白；如果激光強(qiáng)度過(guò)低，信號(hào)采集時(shí)過(guò)多地增大Gain值，就會(huì)噪音點(diǎn)增多，影響圖像質(zhì)量，或者采集不到較弱的信號(hào).隨著激光管使用壽命的增加，激光的亮度會(huì)有所下降，原則上激光強(qiáng)度越低越好.

4.2 針孔(Pinhole)的調(diào)節(jié)

針孔直徑的大小決定了采集的熒光信號(hào)多少及切片的厚度，針孔越大，獲得的熒光信號(hào)越多，切片的厚度越大，同時(shí)獲得的非焦平面的信號(hào)也增多，背景較高.因此，在保證圖片質(zhì)量的前提下，針孔直徑越小越好，以提高圖像分辨率.

4.3 增益值(Gain)的調(diào)節(jié)

增益值大小的調(diào)節(jié)相當(dāng)于調(diào)節(jié)光電倍增管(PMT)的電壓值，該值的大小直接決定了獲得熒光信號(hào)的多少.Gain值越大，熒光強(qiáng)度越大，圖像亮度越高，同時(shí)噪音點(diǎn)也增多.

4.4 背景扣除(Offset)的調(diào)節(jié)

在采集圖像時(shí)，可以適當(dāng)調(diào)節(jié)Offset鍵，扣除背景的熒光亮度，該值通常設(shè)置在0以下.Offset與Gain相輔相成，在實(shí)際操作中，二者要結(jié)合調(diào)節(jié)，增加Gain值，噪音點(diǎn)增多時(shí)，可以降低Offset值，提高圖像質(zhì)量.

4.5 圖像掃描

用低像素預(yù)覽，高像素獲取圖像.像素是指基本原色素及其灰度的基本編碼，像素越高，分辨率越高，圖像越清晰，反之亦然[10].要獲取高清圖像，不但可以通過(guò)提高像素的方法，還可以采用增加掃描次數(shù)的模式，更好的減少噪音點(diǎn)和背景.但是掃描次數(shù)越多，掃描速度越慢，容易造成熒光淬滅和弱信號(hào)丟失，通常掃描次數(shù)可以選擇2～4次.

4.6 透射光路及DIC(微分干涉差)設(shè)置

共聚焦的透射光圖像也是以激光為光源，由PMT將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，獲取圖像，圖像顏色為偽彩.DIC(Differential Interference Contrast)原理是利用平面偏振光，可使樣品厚度的微小差異轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)微明暗差別，增強(qiáng)立體感，通常用于觀察細(xì)胞的整體輪廓，便于熒光定位[11-12].共聚焦采集的DIC 圖像為非共焦圖像，因此在透射光通道無(wú)法對(duì)樣品進(jìn)行光學(xué)切片.

5 激光掃描共聚焦顯微鏡的在生物學(xué)研究中的應(yīng)用技巧

5.1 多通道熒光及透射光疊加圖像

采用Multi Track模式可以進(jìn)行多種熒光及透射光圖像掃描并疊加，選用不同顏色區(qū)分不同的熒光染料(如圖1).疊加后的圖片能更直觀地觀察不同熒光信號(hào)在生物體內(nèi)的定性及共定位情況.

圖1 多通道熒光及透射光疊加圖像

5.2 Z軸掃描及三維構(gòu)建

利用共聚焦可以去除非焦平面雜散光的特性，可以將較厚的樣品進(jìn)行多層掃描及三維構(gòu)建.在獲取模式下選擇Z-stack，然后在Z軸方向選擇起始層面和終止層面，再根據(jù)樣品的厚度及實(shí)驗(yàn)需求選擇掃描的層數(shù)(keep slice)，或者選擇Z軸步進(jìn)值(keep interval).通常步進(jìn)值為切片厚度的50%可以獲得較高的軸向分辨率[13].如圖2所示.

圖2 三維構(gòu)建圖像

5.3 雙色熒光共定位分析

在多通道熒光疊加圖像上，通過(guò)Histo模式下的Colocalisation功能，可以對(duì)多種熒光信號(hào)進(jìn)行兩兩共定位分析，共定位的部分可以選用另一種顏色標(biāo)記出來(lái)，獲得的圖像及譜圖能更直觀清晰的進(jìn)行熒光信號(hào)的定性定量分析.如圖3所示.

圖3 雙色熒光共定位分析圖像

5.4 熒光強(qiáng)度對(duì)比分析

在Profile模式下選定某一區(qū)域或一條直線范圍，通過(guò)熒光強(qiáng)度峰圖，可以直觀對(duì)比對(duì)照組與處理組不同通道的熒光強(qiáng)度差別.如圖4所示.

圖4 熒光強(qiáng)度對(duì)比分析圖像

5.5 時(shí)間序列(Time Series)掃描

共聚焦可以對(duì)標(biāo)有熒光信號(hào)的活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)，記錄細(xì)胞內(nèi)特定成分的動(dòng)態(tài)變化.共聚焦是以掃描方式成像，成像速度慢，在進(jìn)行時(shí)間序列掃描時(shí)，要想能及時(shí)撲捉到快速變化的信號(hào)，可以降低分辨率，增加掃描速度，或者將面(Frame)掃描變?yōu)榫€(Line)掃描及點(diǎn)(Spot)掃描，但獲取的圖像質(zhì)量也會(huì)降低.時(shí)間序列的掃描時(shí)間可以在軟件直接設(shè)置，也可以由外置設(shè)備(如電生理儀等)進(jìn)行控制.如圖5所示.

圖5 時(shí)間序列掃描圖像

5.6 光漂白(Bleach)掃描

利用光漂白掃描方法可以完成相應(yīng)的熒光光漂白恢復(fù) (FRAP)及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)等實(shí)驗(yàn).先采集一張標(biāo)準(zhǔn)圖像，然后選擇漂白區(qū)域(Define Region)，增大激光強(qiáng)度，再設(shè)定漂白次數(shù)(Iterations)，以實(shí)現(xiàn)熒光快速淬滅的效果.結(jié)合時(shí)間序列掃描方式，就可以完成FRAP及FRET實(shí)驗(yàn).如圖6所示.

圖6 光漂白分析圖像

綜上所述，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡可以獲得高清晰、高質(zhì)量的圖像，還可以擴(kuò)大圖像的信息量，獲得更多的分析結(jié)果，這些功能使得LSCM已成為生物學(xué)研究領(lǐng)域中必不可少的分析儀器[14-15].激光掃描共聚焦顯微鏡可以進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)定位、立體結(jié)構(gòu)重組、動(dòng)態(tài)變化過(guò)程等研究，并能提供定量熒光測(cè)定、定性圖像分析等實(shí)用研究手段，結(jié)合其他相關(guān)生物技術(shù)，在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域?qū)?huì)得到更廣泛應(yīng)用[16-17].

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Technique and application skills of laser scanning confocal microscopy

YUE Lei，ZHANG Yao, MA Zhuo

(School of Life Science and Technology,Harbin Institute of Technology,Harbin 150080,China)

This paper introduced the working principle, conventional sample preparation and production requirements of laser scanning confocal microscopy, as well as the method of image acquisition, including the regulation of light path and light intensity adjustment, gain value and pinhole regulation, transmission light path and DIC settings. And introduced the confocal technique in biological research field, such as multi-track fluorescence collection,Z-stack scanning and three-dimensional construction, analysis of fluorescence colocalisation and intensity, time sequence scanning and bleaching technology. This paper could efficiently provide technical reference for grasping the confocal operation skills.

laser scanning confocal microscopy; image; application

2015-04-10.

岳 磊(1979-)，女，博士，工程師，研究方向：蛋白質(zhì)功能.

R446

A

1672-0946(2015)03-0263-04