霍朗寧 張東升 賈忠奎

(省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083) (國(guó)家林業(yè)局) (省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)))

樹莓‘沙尼’組培技術(shù)1)

霍朗寧 張東升 賈忠奎

(省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083) (國(guó)家林業(yè)局) (省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)))

應(yīng)用樹莓(RubusideausL.)的優(yōu)良品種‘沙尼’(‘Shawnee’)進(jìn)行組織培養(yǎng)技術(shù)的探索和研究，以期為樹莓的大量繁育和推廣提供技術(shù)支撐。結(jié)果表明：最佳外植體的選擇為帶芽莖段，最佳的取材時(shí)間為5月份，萌發(fā)率可達(dá)100%。最佳滅菌體系的流程為75%酒精浸泡30 s后無菌水沖洗3～4次，然后再以2% NaClO滅菌20 min后無菌水沖洗3次,污染率達(dá)到0%。‘沙尼’的最佳初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1；最佳繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1，增殖系數(shù)為3.49；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 1.0 mg·L-1，生根率為100%，植株可平均生出2 cm的健壯根系10條。

樹莓；‘沙尼’；組織培養(yǎng)

In order to breed and popularize the raspberry efficiently, we focused on the Shawnee, a fine-cultivar of raspberry (RubusideausL.), and studied the technology system of tissue culture. The stem section with a bud is an optimum explant while spring in May is an optimum time with the germination rate of 100%. After soaking with 75% alcohol for 30 s and flushing with sterile water for 3-4 times, 2% NaClO to sterilize 20 min before flushing by sterile water for 3 times is an optimum program of sterilization without the contamination. MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1is an optimum early generation culture medium, MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1is an optimum subculture generation culture medium (4.55 proliferation ratio), and 1/2MS+IBA 1.0 mg·L-1is an optimum strike root culture medium (100% root productive ratio, two individual of strong roots and mean length of 10 cm).

樹莓果實(shí)有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，既是很好的鮮果食品，也可加工成果汁、果酒、果干蜜餞等食品。隨著人們對(duì)樹莓認(rèn)識(shí)的不斷提高，樹莓將成為我國(guó)新興果業(yè)的先鋒樹種，發(fā)展前景十分廣闊[1]。采用常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)繁殖方法無法在短時(shí)間內(nèi)獲得大量苗木，而組培快繁的方法具有更好的優(yōu)勢(shì)[15]。通過樹莓組織培養(yǎng)技術(shù)推動(dòng)快速繁殖優(yōu)良苗是一個(gè)重要的趨勢(shì)，亟需建立一套完整的組織培養(yǎng)技術(shù)體系。

在組織培養(yǎng)技術(shù)中，基本培養(yǎng)基的種類、碳源的種類和濃度是為試管苗提供營(yíng)養(yǎng)的關(guān)鍵因子，也是試管苗生長(zhǎng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。外界環(huán)境條件是組織培養(yǎng)中重要因素之一，特定物種植株對(duì)光照、溫度、濕度、培養(yǎng)基酸堿度、氣體成分等方面有特定要求。樹莓正常生長(zhǎng)的環(huán)境條件大致為培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度1 500～2 500 lx，光照時(shí)間10～15 h·d-1，相對(duì)濕度40%～80%，培養(yǎng)基pH值5.4～5.8[13]。

樹莓外植體的選擇主要集中于莖段、莖尖、葉片、腋芽4種。其中前三種類型的外植體誘導(dǎo)率由大到小的排序?yàn)榍o段(79.3%)、莖尖(45.4%)、葉片(較低)；出芽率由大到小的排序?yàn)榍o段(50.6%)、莖尖(40.8%)、葉片(較低)[3]。在初代培養(yǎng)中，莖段的誘導(dǎo)率相對(duì)較高，帶芽莖段是樹莓組織培養(yǎng)較佳的外植體材料[2]。而相比莖段、莖尖、葉片外植體，腋芽的誘導(dǎo)效果較好，消毒效果更好，并且對(duì)于組織傷害作用小，在初代培養(yǎng)中具有較好的發(fā)芽率，因此，腋芽也是較佳的外植體[4-5，16]，但由于腋芽的體積都很小，單獨(dú)取下進(jìn)行培養(yǎng)增大了試驗(yàn)操作難度，對(duì)芽體損傷較大，存活率低，容易造成操作損傷。在外植體的采集時(shí)機(jī)上，春季采集的污染率顯著低于其他季節(jié)的，即春季是最好的取材時(shí)間[2，6]。

在植物愈傷組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑起著傳遞遺傳物質(zhì)的脫分化、再分化等發(fā)育信號(hào)的作用，它是誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生和分化的極為重要的因素，激素的成分、配比和質(zhì)量濃度會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重大的影響[12，17]，對(duì)于初代培養(yǎng)效果來說，萌發(fā)率、外植體是否伸長(zhǎng)生長(zhǎng)是最重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，在繼代培養(yǎng)中，萌發(fā)率、增殖系數(shù)、外植體是否伸長(zhǎng)生長(zhǎng)是最重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)[3，5，7]。在初代培養(yǎng)基礎(chǔ)上，獲得的芽和組培苗的數(shù)量有限，不能充分發(fā)揮組織培養(yǎng)快速繁殖的優(yōu)勢(shì)，可通過繼代繁殖獲取大量增殖材料。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物的質(zhì)量濃度以及某些元素的濃度等顯得非常重要，在樹莓的繼代增殖過程中常用的生長(zhǎng)素類激素有NAA、IBA，細(xì)胞分裂素類激素有6-BA、KT、ZT、赤霉素(GA3)等[8]。

然而，針對(duì)已有的樹莓組織培養(yǎng)體系相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種的樹莓最適培養(yǎng)基激素質(zhì)量濃度、配比等多方面結(jié)果不盡相同，甚至還出現(xiàn)針對(duì)相同品種，在不同的研究中，其結(jié)論存在矛盾的現(xiàn)象。因此，本試驗(yàn)整合已有研究中的結(jié)果為最適的激素質(zhì)量濃度、配比等信息進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以期對(duì)比對(duì)于‘沙泥’這個(gè)品種來說，哪種條件下的培養(yǎng)為最佳培養(yǎng)，從而建立健全‘沙尼’組織培養(yǎng)快速繁育體系，為其大量生產(chǎn)繁殖提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料為引種于美國(guó)的優(yōu)良樹莓品種‘沙尼’(‘Shawnee’)，植株多刺、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)壯、產(chǎn)量較高。生長(zhǎng)正常的植株于2013年4月份從北京市房山區(qū)樹莓生產(chǎn)基地移植至花盆內(nèi)進(jìn)行根蘗基質(zhì)栽培；分別以帶腋芽莖段、莖尖為外植體材料，從枝條上取2～5個(gè)帶芽莖段(自莖尖下部開始，一般為單芽莖段)，莖尖分別取自枝條頂端。取下的外植體置于水中，移至試驗(yàn)室進(jìn)行外植體接種試驗(yàn)。

培養(yǎng)條件：組培室的培養(yǎng)條件為室溫(25±2)℃，空氣相對(duì)濕度60%左右，采用每日光照培養(yǎng)16 h(06:00—22:00)和暗培養(yǎng)8 h的光周期。每個(gè)培養(yǎng)架的光照由2根40 W的直管型熒光燈管提供，強(qiáng)度為2 000～3 000 lx。試驗(yàn)初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)都采用MS培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)采用1/2MS培養(yǎng)基，并加入30 g蔗糖作為碳源[15]。

最佳外植體的選擇：將單芽莖段、莖尖(外植體)置于流動(dòng)水中沖洗0.5 h，初步完成滅菌工作后置于超凈工作臺(tái)再次消毒(75%酒精30 s，3% NaClO-15 min)和剪切處理，將外植體接種于MS培養(yǎng)基上，30 d后觀察外植體生長(zhǎng)勢(shì)，通過外植體萌發(fā)率的比較，選出適合樹莓組織培養(yǎng)的最佳外植體類型，其中萌發(fā)率=(萌發(fā)外植體數(shù)/接種總數(shù))×100%。將選出的外植體分別于5、6、8月份取材和接種(繼代培養(yǎng))，通過觀察繼代培養(yǎng)外植體的污染率和繼代增殖系數(shù)，確定沙尼組織培養(yǎng)的最佳取材時(shí)間，其中，污染率=(接種污染數(shù)/接種總數(shù))×100%，增殖系數(shù)=每次繼代切割所得帶芽莖段數(shù)/原接種帶芽莖段數(shù)。

最佳滅菌體系的建立：取健壯的帶芽莖段、莖尖置于流動(dòng)水中沖洗0.5 h，再用75%酒精進(jìn)行30 s的初步滅菌(超凈工作臺(tái))，根據(jù)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)滅菌劑NaClO、不同滅菌時(shí)間進(jìn)行消毒試驗(yàn)。經(jīng)過2% NaClO-15 min、3% NaClO-15 min、2% NaClO-20 min三種預(yù)處理后，將外植體接種于MS培養(yǎng)基中，于1周后觀察外植體污染情況并統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率、成活率等，建立帶芽莖段的最佳滅菌體系。每種處理接種20個(gè)外植體。

初代培養(yǎng)體系的建立：在外植體處理和滅菌后，將帶芽莖段接種到加有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(6-BA，NAA、IAA)的MS培養(yǎng)基上(表1)，30 d后觀察統(tǒng)計(jì)外植體的萌發(fā)率和生長(zhǎng)勢(shì)，并結(jié)合增殖情況篩選出最佳的初代培養(yǎng)體系。每種處理組合接種20個(gè)外植體。

表1 初代培養(yǎng)激素處理設(shè)計(jì)

繼代培養(yǎng)體系的建立：將初代培養(yǎng)的試管苗剪成單芽莖段，接種時(shí)添加不同質(zhì)量濃度的6-BA和NAA、IAA、GA的MS培養(yǎng)基(表2)，每種處理重復(fù)20次，接種30 d后調(diào)查增殖系數(shù)。

表2 繼代培養(yǎng)激素處理設(shè)計(jì)

生根培養(yǎng)體系的建立：將帶芽莖段在初代培養(yǎng)(器官發(fā)生途徑)下生成的試管苗接種到生根培養(yǎng)基上(共6個(gè)處理，表3)，30～40 d觀察生根情況。每種處理接種20個(gè)組培植株。

表3 生根培養(yǎng)激素處理設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳外植體的選擇

外植體類型的選擇：將滅菌的樹莓‘沙尼’帶芽莖段、莖尖外植體分別接種于MS基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，帶芽莖段的萌發(fā)率為88.6%，莖尖萌發(fā)率為20.0%，表明‘沙尼’在組織培養(yǎng)中帶芽莖段應(yīng)選為最佳外植體。

最佳采集時(shí)間的確定：隨著植物生長(zhǎng)速度加快，原先的嫩枝條內(nèi)不斷木質(zhì)化，在相同條件下的消毒效果都有明顯差異，污染率顯著增加，‘沙尼’的增殖系數(shù)呈明顯下降趨勢(shì)；外植體最佳取材時(shí)間為5月份，此時(shí)污染率低，并且能維持較高的增殖系數(shù)，為之后的繼代培養(yǎng)提供基礎(chǔ)。

2.2 最佳消毒滅菌體系

對(duì)樹莓消毒的NaClO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～3%，消毒時(shí)間在15～20 min[15]，本研究經(jīng)過2% NaClO-15 min、3% NaClO-15 min、2% NaClO-20 min三種預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)2% NaClO-15 min的處理污染率極高(淘汰)，而3% NaClO-15 min、2% NaClO-20 min對(duì)芽體有一定的傷害作用，表現(xiàn)為個(gè)別腋芽生長(zhǎng)勢(shì)較差，因此，不再設(shè)置更高質(zhì)量分?jǐn)?shù)或更長(zhǎng)時(shí)間的NaClO消毒，重點(diǎn)研究3% NaClO-15 min、2% NaClO-20 min的消毒滅菌作用。對(duì)于‘沙尼’品種，兩種消毒處理的污染率分別為4.5%和0，消毒效果都較好，但2% NaClO-20 min相對(duì)較好，‘沙尼’莖上有較長(zhǎng)、軟硬不同的枝刺，以及飽滿的枝條，在一定程度上影響了消毒效果。

2.3 初代培養(yǎng)體系的建立

帶芽莖段接種于分別加有6-BA、NAA、IAA和GA的5種初代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10 d左右，葉芽迅速膨大萌發(fā)新葉，大部分外植體可以完成啟動(dòng)生長(zhǎng)。在初代培養(yǎng)過程中，萌發(fā)率和植株生長(zhǎng)勢(shì)是最為重要的指標(biāo)；其次為是否具有伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，便于繼代培養(yǎng)的操作；再次為增殖系數(shù)大小，增殖系數(shù)大的外植體通過繼代培養(yǎng)，可達(dá)到更好的增殖效果。綜合可知，‘沙尼’品種初代培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1(處理3)的增殖系數(shù)雖然不高(9.86)，但其萌發(fā)率100%且具有最好的生長(zhǎng)勢(shì)，所以，最佳的初代培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)選處理3。IAA0.3 mg·L-1時(shí)，植株呈明顯的團(tuán)狀生長(zhǎng)，增殖系數(shù)較高，但莖不伸長(zhǎng)；將生長(zhǎng)素質(zhì)量濃度增至IAA0.5 mg·L-1以及NAA0.10 mg·L-1時(shí)則莖伸長(zhǎng)、增殖系數(shù)有所降低(表4)，因此，可在此范圍內(nèi)調(diào)整生長(zhǎng)素質(zhì)量濃度，可以得到較快伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、增殖率高的愈傷組織。

表4 初代培養(yǎng)不同激素處理效果比較

注：表中增殖系數(shù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 繼代培養(yǎng)體系的建立

初代培養(yǎng)的健壯植株在無菌條件下剪成單芽莖段，將帶芽莖段接種于分別加有6-BA、NAA、IAA和GA的5種繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10d左右觀察，繼代單芽莖段產(chǎn)生一定的愈傷組織，繼代培養(yǎng)的增殖系數(shù)為1.12～3.49(表5)。綜合考慮植株的增殖系數(shù)、生長(zhǎng)勢(shì)發(fā)現(xiàn)，‘沙尼’的最佳繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。

2.5 生根培養(yǎng)體系的建立

將經(jīng)過初代和繼代培養(yǎng)的壯苗接種(無菌條件)到分別加有NAA、IBA的1/2MS培養(yǎng)基中，經(jīng)過40 d左右，大多數(shù)植株產(chǎn)生愈傷組織，并開始生根，60 d左右部分植株產(chǎn)生了主根和須根(健全的根系，表6)。健壯完整的根系是植株在苗圃煉苗時(shí)成活的重要基礎(chǔ)；調(diào)查生根率、根數(shù)量、長(zhǎng)度、粗細(xì)等根系的指標(biāo)，不同種類激素對(duì)植株生根的影響不同，‘沙尼’表現(xiàn)最佳的為4號(hào)處理(生根率100%，最高，根數(shù)量和根長(zhǎng)都較好)，所以，最佳生根培養(yǎng)基為MS+IBA 1.0 mg·L-1。

表5 繼代培養(yǎng)不同激素處理效果比較

注：表中增殖系數(shù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表6 生根培養(yǎng)不同激素處理效果比較

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

選擇樹莓優(yōu)良品種‘沙尼’作為試驗(yàn)材料，初步對(duì)樹莓的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了研究，以期能為樹莓的擴(kuò)繁體系提供一定的技術(shù)支撐。

最佳外植體的選擇：以帶芽莖段、莖尖兩種外植體類型進(jìn)行初代培養(yǎng)，結(jié)果表明，樹莓進(jìn)行組織培養(yǎng)的最佳外植體類型為帶芽莖段，該結(jié)論與其他類似的研究基本一致[2-3]。本試驗(yàn)沒有研究‘沙尼’品種單個(gè)腋芽的組織培養(yǎng)是否高于帶芽莖段，樹莓腋芽的組織培養(yǎng)需要做進(jìn)一步的研究[16]。最佳外植體的最佳取材時(shí)間為5月份，該結(jié)論與其他類似的研究中4—5月份為最佳取材時(shí)間基本一致[2，6]，還需要進(jìn)一步對(duì)組織分化程度和物候差異等因素進(jìn)行研究。

最佳滅菌體系的建立：以帶芽莖段為外植體的初代培養(yǎng)，最佳的滅菌條件為2% NaClO-20 min，低于3% NaClO-15 min的4.5%的污染率。僅采用‘沙尼’為材料，試驗(yàn)結(jié)果的代表性還不夠，與同類試驗(yàn)的滅菌體系0.5% NaClO-20 min不同[3，11]，這可能是品種、所取材料的發(fā)育程度等造成的，還需要做進(jìn)一步的研究。

初代培養(yǎng)體系的建立：試驗(yàn)設(shè)計(jì)未采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]，而是通過總結(jié)已有研究中的結(jié)論，對(duì)比出最優(yōu)的不同激素組合及質(zhì)量濃度[15]。隨著生長(zhǎng)素類激素質(zhì)量濃度的增加，對(duì)接種的植株的伸長(zhǎng)促進(jìn)作用明顯，但是同時(shí)會(huì)降低植株的增殖情況，接種試驗(yàn)說明，生長(zhǎng)素類激素的使用對(duì)外植體愈傷組織的發(fā)育影響較大，一般使用范圍為IAA0.3～0.5 mg·L-1，NAA0.05～0.10 mg·L-1。

繼代培養(yǎng)體系的建立：與初代培養(yǎng)一樣，繼代培養(yǎng)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)也注重不同種類激素組合的不同效果比較，試驗(yàn)處理是已有研究中證實(shí)為最優(yōu)的激素質(zhì)量濃度[15]，試驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)研究有一定差異[6，8-9]，可能是由于試驗(yàn)品種不同造成的差異。通過試驗(yàn)可知，6-BA、NAA的組合往往比加其他激素(如GA、IAA)的效果好，無論是生長(zhǎng)素IAA還是赤霉素GA促進(jìn)植株伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的作用都不明顯，反而在一定程度上降低了增殖效果?！衬帷诩?xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素水平都最低時(shí)具有最高的增殖效果和最佳的生長(zhǎng)狀況，說明‘沙尼’這一品種可以較快適應(yīng)低水平質(zhì)量濃度激素；在試驗(yàn)的過程中還發(fā)現(xiàn)，‘沙尼’在初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)中可自行進(jìn)行生根，說明該品種植株體內(nèi)激素的自我調(diào)節(jié)能力很強(qiáng)。

生根培養(yǎng)體系的建立：生根培養(yǎng)在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)也總結(jié)了已有的研究成果，‘沙尼’的生根培養(yǎng)的最優(yōu)處理與和加衛(wèi)等[5]的結(jié)果一致，但與部分研究中指出的最佳處理1、3、5號(hào)(表3)的不一致[6-8，10]，這可能與品種、外植體材料的發(fā)育程度不同有關(guān)?！衬帷褂肐BA進(jìn)行生根培養(yǎng)的效果優(yōu)于NAA，而僅用NAA與使用NAA+IBA組合的生根作用大體相似，因此,僅使用IBA進(jìn)行生根不僅節(jié)約時(shí)間成本，更提高了生根率，促進(jìn)形成完整健壯的根系。

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Tissue Culture for Orus of Raspberry (RubusideausL.) Cultivar

Huo Langning(Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Zhang Dongsheng(State Forestry Administration); Jia Zhongkui(Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education, Beijing Forestry University)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：6-9.

Raspberry; Shawnee; Tissue culture

霍朗寧，女，1991年12月生，省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，碩士研究生。E-mail：254516267@qq.com。

賈忠奎，省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，副教授。E-mail：jiazk@bjfu.edu.cn。

2014年10月28日。

S663.2； Q943.1

1)新疆維吾爾自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(201231108)、北京林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(120104)。

責(zé)任編輯：任 俐。