柳青(曲靖市第一人民醫(yī)院腫瘤科,云南曲靖 655000)

多烯紫杉醇對(duì)乳腺癌細(xì)胞T47D增殖與凋亡的影響及其機(jī)制研究

柳青
(曲靖市第一人民醫(yī)院腫瘤科,云南曲靖 655000)

摘要目的:觀(guān)察多烯紫杉醇對(duì)人乳腺癌細(xì)胞T47D增殖與凋亡的影響及其機(jī)制研究。方法:用不同濃度(0、5、10、20 nmol·L-1)多烯紫杉醇作用于人乳腺癌細(xì)胞T47D后,采用MTT法觀(guān)察多烯紫杉醇對(duì)人乳腺癌細(xì)胞T47D增殖的影響,并使用流式細(xì)胞術(shù)及Hoechst33258染色檢測(cè)多烯紫杉醇對(duì)T47D細(xì)胞凋亡的影響,采用RT-PCR檢測(cè)T47D細(xì)胞bcl-2 m RNA表達(dá)情況。結(jié)果:經(jīng)多烯紫杉醇處理后,MTT結(jié)果顯示T47D細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著上升(P<0.05),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示T47D細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),并且Hoechst33258染色檢測(cè)T47D細(xì)胞呈凋亡狀態(tài)。此外,RT-PCR檢測(cè)T47D細(xì)胞bcl-2 m RNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。結(jié)論:多烯紫杉醇通過(guò)誘導(dǎo)凋亡能抑制人乳腺癌細(xì)胞T47D的增殖,這可能與其下調(diào)bcl-2 m RNA表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:多烯紫杉醇;T47D細(xì)胞;增殖與凋亡;Bcl-2 mRNA

乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤,全世界每年約有120萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌,占女性所有腫瘤的18%[1]。盡管WHO數(shù)據(jù)顯示中國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率最低,但我國(guó)乳腺癌發(fā)病率依然達(dá)到了23/10萬(wàn),占全國(guó)惡性腫瘤的7%~10%,成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[2]。目前乳腺癌的治療手段主要有外科手術(shù)、放射治療和化療等,但是手術(shù)治療給患者所帶來(lái)的是嚴(yán)重的身心傷害,放射和化療也對(duì)患者的身體產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用損傷。因此,發(fā)展新的治療策略,從分子靶點(diǎn)上尋找一種高效低毒的抗乳腺癌藥物對(duì)提高乳腺癌病人的生存率和后期康復(fù)具有重大意義。

多烯紫杉醇前體是從歐洲紫杉的針葉中提取,經(jīng)半合成而獲得,近年來(lái),國(guó)內(nèi)外已有研究表明多烯紫杉醇對(duì)肺癌、食管癌、乳腺癌、白血病等惡性腫瘤能誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡[3-4]。因此,本實(shí)驗(yàn)以人乳腺癌細(xì)胞T47D作為研究對(duì)象,觀(guān)察不同濃度多烯紫杉醇作用T47D細(xì)胞株后細(xì)胞增殖、凋亡的情況,并觀(guān)察T47D細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)水平的變化,探討其可能的作用機(jī)制,為多烯紫杉醇臨床應(yīng)用于乳腺癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

T47D細(xì)胞株(上海細(xì)胞生物研究所),RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司),多烯紫杉醇(法國(guó)安萬(wàn)特公司),熒光染料Hoechst33258、MTT(美國(guó)Sigma公司),流式細(xì)胞儀(美國(guó)COULER公司),V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天研究所),其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

T47D細(xì)胞在含10%胎牛血清(FBS)和100 U·ml-1青霉素、100 U·ml-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 藥物配制

多烯紫杉醇用DMSO配制成濃度1μmol·L-1的藥液,置于4℃冰箱避光保存,用時(shí)以含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成所需要的濃度。

1.2.3 T47D細(xì)胞增殖活性檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)T47D細(xì)胞增殖活性。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,按5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中,每孔加入細(xì)胞懸液100μl。細(xì)胞貼壁后,分別加入多烯紫杉醇使得終濃度為(5、10、20 nmol·L-1),另設(shè)對(duì)照組(不含多烯紫杉醇),每組設(shè)5個(gè)副孔。藥物分別作用24、48、72 h后,棄上清,以MTT法用酶標(biāo)儀測(cè)每組的吸光值(A490),實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4 T47D細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T47D細(xì)胞凋亡率。將消化后收集到的T47D細(xì)胞懸液調(diào)整濃度,按每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種到6孔板中。待細(xì)胞完全貼壁后,加入含不同濃度多烯紫杉醇(5、10、20 nmol·L-1)的完全培養(yǎng)基,另設(shè)對(duì)照組(加入等體積完全培養(yǎng)基),每組設(shè)5個(gè)副孔。培養(yǎng)48 h后,收集各組的細(xì)胞,以預(yù)冷的PBS溶液洗滌3次后,用Annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)(50μg·ml-1)室溫避光染色15 min后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.2.5 T47D細(xì)胞凋亡形態(tài)觀(guān)察

采用Hoechst染色法觀(guān)察T47D細(xì)胞凋亡形態(tài)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種至6孔板中,待細(xì)胞完全貼壁后,用不同濃度多烯紫杉醇(5、10、20 nmol·L-1)處理T47D細(xì)胞,另設(shè)對(duì)照組(加入等體積完全培養(yǎng)基),每組設(shè)5個(gè)副孔。作用48 h后,棄上清,先后加入固定液和Hoechst33258染色液,37oC條件下染色10 min。以熒光倒置顯微鏡檢測(cè),激發(fā)波長(zhǎng)350 nm,鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.6 T47D細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)T47D細(xì)胞bcl-2 m RNA表達(dá)。各濃度多烯紫杉醇(0、5、10、20 nmol·L-1)處理T47D細(xì)胞48 h后,收集T47D細(xì)胞總RNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)總RNA純度和含量,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后用用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,β-actin上游引物:5'-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3';下游引物:5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3',擴(kuò)增片段長(zhǎng)度416 bp。Bcl-2擴(kuò)增上游引物:5'-GGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3';下游引物5'-CCAAACTGAGCAGAGTCTTC-3',擴(kuò)增片段長(zhǎng)度234 bp。PCR反應(yīng)條件: 95oC預(yù)變性3 min,93oC 30 s,56oC30 s,70oC 60 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72oC 5 min,4oC holding。擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠分析系統(tǒng)記錄分析。以β-actin為內(nèi)參,結(jié)果以bcl-2/β-actin密度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,以±SD表示,P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多烯紫杉醇抑制T47D細(xì)胞增殖

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),高濃度多烯紫杉醇對(duì)T47D細(xì)胞的增殖起明顯抑制作用,圖1可看出,與對(duì)照組比較,隨多烯紫杉醇濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng),多烯紫杉醇處理組(5、10、20 nmol·L-1) T47D細(xì)胞數(shù)目顯著減少,增殖能力受到明顯抑制。

圖1　不同濃度多烯紫杉醇處理T47D細(xì)胞后24、48、72h后的增殖情況

2.2 多烯紫杉醇促進(jìn)T47D細(xì)胞的凋亡

對(duì)T47D細(xì)胞進(jìn)行Hoechst33258染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組T47D細(xì)胞核形態(tài)均勻,結(jié)構(gòu)正常,見(jiàn)圖2A。而多烯紫杉醇處理組(5、10、20 nmol·L-1)的T47D細(xì)胞中可見(jiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài),包括細(xì)胞核碎裂和細(xì)胞皺縮,見(jiàn)圖2B-2D。對(duì)T47D細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀測(cè)定發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,多烯紫杉醇處理組(5、10、20 nmol·L-1)的凋亡細(xì)胞率均明顯升高,凋亡率隨藥物濃度增加逐漸上升,各實(shí)驗(yàn)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3。

圖2　不同濃度多烯紫杉醇處理T47D細(xì)胞48h的熒光顯微照片(×400)注:A:對(duì)照組細(xì)胞;B:5nmol·L-1多烯紫杉醇;C:10nmol·L-1多烯紫杉醇;D:20 nmol·L-1多烯紫杉醇;箭頭所示為細(xì)胞出現(xiàn)核碎裂和細(xì)胞皺縮

圖3　不同濃度多烯紫杉醇處理T47D細(xì)胞48h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率注:與對(duì)照組比較,*P<0.05

2.3 多烯紫杉醇降低bcl-2 m RNA表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,多烯紫杉醇組(5、10、20 nmol·L-1)的T47D細(xì)胞bcl-2 m RNA表達(dá)水平隨藥物濃度增加明顯降低,呈劑量依賴(lài)性,各藥物組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖4。

3 討論

乳腺癌是女性較為常見(jiàn)的惡性腫瘤,發(fā)病率在我國(guó)居女性惡性腫瘤的第二位[5]。目前針對(duì)乳腺癌的治療尚無(wú)統(tǒng)一方案,因此尋找新的抗乳腺癌藥物,是治療乳腺癌的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。多烯紫杉醇屬于細(xì)胞周期特異性抗微管藥物,具有促微管聚合及使細(xì)胞分裂停滯的作用[6]。1994年FDA批準(zhǔn)紫杉醇用于治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌,研究表明此藥治療乳腺癌效果較好[7],而多烯紫杉醇是在對(duì)紫杉醇結(jié)構(gòu)改造過(guò)程中合成出來(lái)的紫杉醇衍生物,相比紫杉醇生物利用度好,毒副作用更小。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們選取乳腺癌T47D細(xì)胞作為模型,用不同濃度多烯紫杉醇處理乳腺癌T47D細(xì)胞,觀(guān)察多烯紫杉醇對(duì)于乳腺癌T47D細(xì)胞增殖和凋亡發(fā)生的作用及可能的機(jī)制。

MTT分析是一種比色分析,可以反映細(xì)胞增殖能力[8]。本研究中通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)多烯紫杉醇處理后的T47D細(xì)胞在72 h內(nèi)增殖速度明顯降低。并且經(jīng)Hoechst染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示T47D細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)變化,且凋亡數(shù)目顯著增多,提示多烯紫杉醇抑制細(xì)胞增殖作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

細(xì)胞凋亡的調(diào)控失常是引發(fā)腫瘤的發(fā)生的重要因素,現(xiàn)有研究表明線(xiàn)粒體通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要通路[9]。線(xiàn)粒體通路主要由bcl-2家族成員所調(diào)控,bcl-2基因是目前公認(rèn)的抗凋亡基因,通過(guò)抑制多種形式的細(xì)胞凋亡過(guò)程致細(xì)胞數(shù)目增加,對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖起促進(jìn)作用[10]。因此,bcl-2 m RNA表達(dá)水平的下降可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本研究中發(fā)現(xiàn),隨著多烯紫杉醇濃度的增加,乳腺癌T47D細(xì)胞bcl-2 m RNA表達(dá)水平呈劑量依賴(lài)性下降,提示多烯紫杉醇抑制乳腺癌T47D細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與下調(diào)bcl-2 m RNA表達(dá)相關(guān)。

圖4　不同濃度多烯紫杉醇處理T47D細(xì)胞后bcl-2/β-actin的比值注:與對(duì)照組比較,*P<0.05

綜上所述,多烯紫杉醇對(duì)抑制乳腺癌T47D細(xì)胞增殖起顯著作用,其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)T47D細(xì)胞凋亡及下調(diào)bcl-2 m RNA表達(dá)有關(guān)。多烯紫杉醇作為臨床用藥有廣闊的前景,其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制還有待深入研究。

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Effects and mechanisms of docetaxel on the proliferation and apoptosis of human breast cancer cells T47D*

Liu Qing
(Department of Oncology,The First People Hospital of Qujing,Yunnan Qujing 655000)

Abstract Objective:To study the effects and the mechanisms of docetaxel on the proliferation and apoptosis of human breast cancer cell T47D.Methods:Human breast cancer cells T47D was exposed to different doses of docetaxel(0,5,10 and 20 nmol·L-1).MTT assay was applied to determine the effects of docetaxel on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells T47D,while apoptosis was assessed by flow cytometry and Hoechst33258 staining.Next,the expression level of bcl-2 m RNA in T47D cell was analyzed by RT-PCR.Results:After docetaxel treatment,the proliferation of T47D cell was significantly inhibited(P <0.05).The increased apoptotic rates by docetaxel was found in T47D cell by flow cytometry(P<0.05),and docetaxel-treated T47D cell exhibited typical apoptotic morphology.Furthermore,docetaxel resulted in reduced expression of bcl-2 m RNA in T47D cells(P<0.05).Conclusions:Docetaxel could inhibit the growth of human breast cancer cell T47D by induction of apoptosis,which may be related with inhibition of bcl-2 m RNA expression.

Key Words:Docetaxel;T47D;Proliferation and apoptosis;Bcl-2 mRNA

(收稿日期：2015-9-6)

作者簡(jiǎn)介:柳青,女,主治醫(yī)師,主要從事甲狀腺乳腺外科的研究,Email: ynfg001@163.com。