謝亞磊賀巾釗李瓊朱玲△(.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院0級基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)國家基地班,四川成都 6004; .四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室,四川成都 6004)

辛伐他汀和阿托伐他汀對人結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞株作用的探究*

謝亞磊1賀巾釗1李瓊2朱玲2△
(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院2011級基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)國家基地班,四川成都 610041; 2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室,四川成都 610041)

摘要目的:初步探究他汀類藥物對人結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞株的毒性作用。方法:以四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測定辛伐他汀(Simvastatin,SV)和阿托伐他汀(Atorvastatin,AV)對結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、肺癌細(xì)胞株A549的細(xì)胞毒作用,計(jì)算兩種藥物對不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。結(jié)果:SV、AV對HCT116的IC50分別為42.992μmol·L-1、47.845μmol·L-1,SV、AV對A549的IC50分別為41.50μmol·L-1、50.06μmol·L-1。結(jié)論:SV、AV對兩種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用,抑制率大小呈劑量依賴性,不同他汀類藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用存在差異。

關(guān)鍵詞:辛伐他汀;阿托伐他汀;結(jié)腸癌細(xì)胞;肺癌細(xì)胞;半數(shù)抑制濃度

他汀類藥物是膽固醇生物合成中甲羥戊酸合成所需羥甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A, HMG-Co A)還原酶的抑制劑,廣泛用于降脂治療,對于心血管疾病的治療具有重要意義[1]。近些年來他汀類藥物的其他多種細(xì)胞生物效應(yīng),尤其是抗腫瘤作用,逐漸受到重視。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種他汀類藥物,可以通過抑制類異戊二烯中間體的合成,來抑制蛋白的翻譯后修飾,通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖和抗血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用[2-4],且他汀類藥物還能增加癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。

目前辛伐他汀(Simvastatin,SV)和阿托伐他汀(Atorvastatin,AV)是他汀類藥物抗腫瘤作用相關(guān)研究的典型代表。兩者均為脂溶性他汀類藥物,但兩者的分子結(jié)構(gòu)不同,已有研究發(fā)現(xiàn)SV和AV在發(fā)揮調(diào)脂和抗腫瘤作用中的等效劑量、生物利用度、蛋白結(jié)合和消除、遺傳藥理學(xué)因素和細(xì)胞作用等均存在差異。相同劑量的AV和SV對心血管的作用可以是相反的[5]。大量的臨床試驗(yàn)和動物模型也證實(shí),辛伐他汀和阿托伐他汀對結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌等多種腫瘤的生長均有抑制作用[6-8]。通過以細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因芯片和生物信息學(xué)分析也為他汀類藥物的抗腫瘤作用提供支持依據(jù)[9]。肺癌和結(jié)腸癌是嚴(yán)重威脅全球人類健康的惡性腫瘤疾病,尤其是發(fā)展中國家,有研究報道2023年肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等的發(fā)病率在這些國家將增長60%[10]。目前肺癌和結(jié)腸癌的化療方案得到廣泛應(yīng)用,使得癌癥患者的壽命有所延長,新的抗腫瘤藥物研究也成為社會關(guān)注的一大熱點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn),在體外實(shí)驗(yàn)中,不同濃度的洛伐他汀對卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、宮頸癌細(xì)胞的抑制作用存在差異[11]。辛伐他汀對于肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞抑制作用具有劑量依賴性[12,13],但尚未深入研究其最適抑制濃度及測定其半數(shù)抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。

根據(jù)已有研究,本實(shí)驗(yàn)通過四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測定AV、SV對人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116、人肺癌細(xì)胞株A549的增殖抑制率和IC50,從而比較不同他汀類藥物的不同濃度對不同腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,同時為今后有關(guān)他汀類藥物對人腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ),為臨床用藥和化療提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

HCT116細(xì)胞株為人結(jié)腸癌上皮來源細(xì)胞,A549細(xì)胞株為人肺腺癌來源細(xì)胞,均由原華西醫(yī)科大學(xué)感染免疫研究室提供,所用培養(yǎng)液為DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液(成都哈里生物工程有限公司),內(nèi)含12%小牛血清(成都哈里生物工程有限公司) 及100μg·ml-1青霉素、100μg·ml-1鏈霉素,于37℃, 5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng),每2天換液傳代一次。二甲基亞砜(DMSO)購自成都寶信實(shí)驗(yàn)儀器經(jīng)營部。SV、AV為純品(大連美侖生物技術(shù)有限公司)純度>99%,用DMSO溶解稀釋成10μmol·ml-1,過濾除菌,-20℃避光凍存。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自成都寶信實(shí)驗(yàn)儀器經(jīng)營部,用PBS緩沖液溶解稀釋至5 mg·ml-1,過濾除菌,-20℃避光凍存?？焖偃鸺先疽?規(guī)格:30 ml)購自南京建成科技有限公司。

1.2 儀器

RDS2-302-125型液氮罐(成都液氮容器公司),0406-1型離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠),SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司),MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)),TS-1型脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司),Bio-Rad i Mark美國酶標(biāo)儀(上海滕柔儀器設(shè)備有限公司),CHK-213倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

將HCT116細(xì)胞株、A549細(xì)胞株從液氮中取出,37℃水浴解凍1~2 min,分別加入2 ml含12%小牛血清、100 U·m L-1青霉素和100 U·m L-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液, 1200 r·min-1離心3 min,棄上清,用相同培養(yǎng)液使細(xì)胞重懸,分裝于培養(yǎng)瓶(5 ml培養(yǎng)液),在5%CO2、37℃飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2天換液傳代一次。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

當(dāng)細(xì)胞(對數(shù)生長期)融合達(dá)80%時,0.25%胰蛋白酶消化,并計(jì)數(shù)。用DMEM高糖培養(yǎng)液懸浮調(diào)整細(xì)胞密度至2.5×104·ml-1,接種于6孔板中,每孔加入2 ml細(xì)胞懸液。待接種完畢后,將6孔板放入5%CO2、37℃飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜。待板中細(xì)胞貼壁后,小心吸棄孔中培養(yǎng)液,進(jìn)行加藥處理。設(shè)置陰性對照組(3個復(fù)孔),每孔分別加2 ml DMEM高糖培養(yǎng)液。SV、AV組藥物濃度均為15、25、50μmol·L-1。每孔分別加藥2 ml。加藥完畢后,放入5%CO2、37℃飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱并計(jì)時。加藥處理完成后24 h后,使用快速瑞氏-姬姆薩染液進(jìn)行染色后,在倒置鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 MTT法測定藥物對細(xì)胞的抑制率

取對數(shù)生長期細(xì)胞,用胰蛋白酶消化后并計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度至2×104·ml-1,接種于96孔培養(yǎng)板,并設(shè)置空白對照組(調(diào)零孔)。待接種完畢后,將96孔板放入5%CO2、37℃飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜。待板中細(xì)胞貼壁后,小心吸棄孔中培養(yǎng)液,進(jìn)行加藥處理。設(shè)置陰性對照組,HCT116細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的SV組藥物濃度為15、25、30、50、60μmol·L-1;HCT116細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的AV組藥物濃度為12.5、25、50、75、100μmol·L-1。A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的AV、SV組藥物濃度為6.25、12.5、25、50、100μmol·L-1。每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔。加藥完畢后,放入5%CO2、37℃飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱并計(jì)時。加藥處理完成后44 h,取出96孔板,向陰性對照組、SV和AV組分別加入5 mg·ml-1MTT溶液,每孔10μl,空白對照組不做處理,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后,取出培養(yǎng)板,小心吸棄各孔中液體,每孔加入100μlDMSO溶液,振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解,用酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長測各孔吸光值(OD值)并記錄。上述操作需小心避光。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

按照下列公式計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組抑制率:抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)操作3次,獲取平均抑制率,并計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)差。計(jì)數(shù)資料以±SD表示,采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,獲取IC50值[14]。采用Graphpad 5.0對不同組別進(jìn)行單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

阿托伐他汀和辛伐他汀均具有明顯的細(xì)胞抑制作用。在倒置鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),陰性對照組細(xì)胞貼壁生長,形態(tài)數(shù)量正常。加藥組細(xì)胞大小明顯較對照組小,同一視野下,加藥組細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量減少,且高濃度組細(xì)胞抑制作用明顯高于中、低濃度,如圖1所示。

2.2 MTT法測定藥物對細(xì)胞的抑制率

MTT法檢測并計(jì)算所得不同濃度SV、AV對HCT116、A549細(xì)胞抑制率大小,如表1所示。在一定范圍內(nèi),隨著藥物濃度的增加,藥物對細(xì)胞的抑制率明顯增加(P<0.01)。中低濃度的AV對人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞、人肺癌A549細(xì)胞的抑制作用高于同濃度SV的腫瘤抑制作用(P<0.01)。同一種他汀類藥物對于不同腫瘤的抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同濃度SV對HCT116細(xì)胞抑制率如圖2A所示,IC50值為42.992μmol·L-1。不同濃度AV對HCT116細(xì)胞抑制率如圖2B所示,IC50值為47.845μmol·L-1。不同濃度SV對A549細(xì)胞抑制率如圖2C所示,IC50值為41.5μmol·L-1。不同濃度AV對A549細(xì)胞抑制率如圖2D所示,IC50值為50.06μmol·L-1。

圖1　AV、SV對HCT116細(xì)胞、A549細(xì)胞形態(tài)的影響(×40)A-D為不同濃度阿托伐他汀作用于HCT116細(xì)胞;E-H為不同濃度阿托伐他汀作用于A549細(xì)胞;I-L為不同濃度辛伐他汀作用于HCT116細(xì)胞;M-P為不同濃度辛伐他汀作用于A549細(xì)胞。

表1　不同濃度SV、AV對HCT116、A549的抑制率(±SD,n=18)

表1　不同濃度SV、AV對HCT116、A549的抑制率(±SD,n=18)

抑制率(100%)劑量(μmol·L-1) 6.25　12.5　15　25　30　50　60　75　100 SV-HCT116　-　-　31.5±2.4　 40.4±1.1　 50.1±2.5　 59.5±1.8　 66.8±1.0　-　-AV-HCT116　-　24.7±0.3　-　42.3±1.1　-　49.8±0.4　-　65.3±1.6 71.3±0.7 SV-A549　15.5±9.9　 18.3±9.4　-　32.3±5.8　-　44.3±7.3　-　-　79.0±3.5 AV-A549　21.5±1.7　 33.6±1.1　-　42.9±0.5　-　51.4±1.1　-　-　70.5±0.7

圖2　不同濃度他汀類藥物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制

3 討論

結(jié)直腸癌、肺癌是全球常見癌癥疾病,嚴(yán)重威脅人類健康生存,一直以來都是全球關(guān)注的焦點(diǎn)[15]。早期的惡性腫瘤的治療以手術(shù)治療為主,常伴有術(shù)后放化療,化療藥物主要有氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱、替加氟/尿嘧啶、奧沙利鉑、依立替康等[16]。除此之外,腫瘤的治療方式還有分子靶向治療,如西妥昔單抗和貝伐單抗。近年來,他汀類藥物抑制腫瘤生長的作用得到廣泛認(rèn)可,有流行病學(xué)調(diào)查顯示長期服用他汀類藥物組患結(jié)腸癌的風(fēng)險要比不服用他汀類藥物組低47%[17]。目前有關(guān)他汀類藥物對腫瘤作用機(jī)制的研究多集中在細(xì)胞水平,其可通過干擾多條信號通路,影響細(xì)胞周期來發(fā)揮抗腫瘤作用,同時他汀類藥物對正常細(xì)胞的影響較小,因而是一個十分具有前景的抗腫瘤藥物。

本實(shí)驗(yàn)采用的MTT用于檢測藥物作用于細(xì)胞的抑制率具有方便快捷、簡單易行、無放射性等特性,使得其不僅廣泛用于腫瘤細(xì)胞機(jī)制相關(guān)研究也廣泛用于臨床,通過癌細(xì)胞藥敏實(shí)驗(yàn)對腫瘤化療有重要指導(dǎo)意義。

本實(shí)驗(yàn)以MTT法測定不同濃度的SV、AV對HCT116、A549的細(xì)胞毒作用,驗(yàn)證了他汀類藥物對細(xì)胞增殖確實(shí)有抑制效應(yīng),結(jié)合已有的文獻(xiàn)報道,通過比較不同他汀類藥物對不同腫瘤細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)的不同點(diǎn),說明SV與AV對腫瘤的抑制作用存在差異。本實(shí)驗(yàn)通過測定不同他汀類藥物對不同腫瘤細(xì)胞的IC50,不僅為后期開展他汀類藥物對腫瘤細(xì)胞作用機(jī)制的相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),而且對新的抗不同腫瘤藥物的開發(fā),臨床應(yīng)用劑量等具有指導(dǎo)意義,同時也為今后他汀類藥物在不同腫瘤的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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Study on the effects of atorvastatin and simvastatin on human colon cancer and lung cancer cells*

Xie Ya-Lei1,He Jin-Zhao1,Li Qiong2,Zhu Ling2△
(1.Basic Medical Base Class 2011,Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041; 2.Department of Pharmacology,Preclinical and Forensic Medicine,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610041)

Abstract Objective:To measure the cytotoxic effects of the statins on human cancer cells.Methods:The cytotoxic effects of the statins on human colon cancer cells HCT116 and lung cancer cells A549 were measured by MTT to determine IC50values of atorvastatin and simvastatin on HCT116 and A549.Results:IC50values of atorvastatin on HCT116 is 42.992μmol·L-1,IC50values of simvastatin on HCT116 is 47.845μmol·L-1·IC50values of simvastatin on A549 is 41.5μmol·L-1,IC50values of atorvastatin on A549 is 50.06μmol·L-1.Conclusion:SV and AV could inhibit the proliferation of cancer cells.Statins inhibit cancer cells in a dosedependent manner,different statins have different effects on cancer cells.

Key Words:Simvastatin;Atorvastatin;Colon cancer cells;Lung cancer cells;IC50values

(收稿日期：2015-8-24)

通訊作者:△朱玲,女,教授,主要從事化療藥理學(xué)、時間藥理學(xué)研究, Email:zhuling529@163.com。

作者簡介:謝亞磊,男,四川大學(xué)2011級基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)本科生,Email:ange10070420@163.com。

*基金項(xiàng)目:國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金能力提高項(xiàng)目資助(編號: J1103604)