李　迎,畢連紅,宋玉國

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林132011)

熒光定量PCR檢測miRNA-155在過敏性皮膚病中的應(yīng)用研究

李迎,畢連紅,宋玉國*

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林132011)

摘要：目的建立熒光定量PCR技術(shù)檢測外周血miRNA-155相對含量檢測方法，研究過敏性皮膚病患者外周血miRNA-155表達量與正常對照組的差異。方法利用miRNA分離純化盒提取外周血血漿中的miRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，采用SYBR Green熒光染料法進行定量PCR檢測40例蕁麻疹患者、30例皮膚濕疹患者和30例健康對照組外周血中miRNA-155的表達含量。結(jié)果蕁麻疹患者外周血中的miRNA-155的表達水平明顯高于正常對照組((P<0.01)，也高于皮膚濕疹患者(P<0.05)；皮膚濕疹患者與正常對照組比較miRNA-155的表達水平無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論熒光定量PCR技術(shù)檢測外周血miRNA-155相對含量有助于蕁麻疹的診斷，為進一步研究蕁麻疹的發(fā)病機制奠定實驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蕁麻疹；微小RNA；熒光定量PCR

(ChinJLabDiagn,2015,19:2036)

microRNAs(miRNAs)是一類由高等真核生物基因組編碼的微小RNA。miRNA不能翻譯成蛋白質(zhì)，但有調(diào)控基因的功能[1]。miRNA具有龐大的數(shù)量，在人體內(nèi)就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1000種以上的miRNA，絕大多數(shù)參與正常的生理調(diào)節(jié)，少數(shù)參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程。miR-155 是免疫系統(tǒng)最重要的miRNA 之一，在固有免疫應(yīng)答[2]、適應(yīng)性免疫應(yīng)答[3，4]以及炎癥性疾病[5]中均發(fā)揮重要作用。miRNA的檢測方法較多，應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測血漿中miRNA是一種準確、快速的方法，且可達到定量目的。本文應(yīng)用該方法定量檢測miRNA-155，并研究其在過敏性皮膚病中的應(yīng)用價值。

1資料與方法

1.1研究對象

病例選自2014年1月至2015年4月期間，北華大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科就醫(yī)患者。其中蕁麻疹患者40例，男16例，女24例，年齡37.80±9.67歲；皮膚濕疹患者30例，男13例，女17例，年齡41.20±15.37歲。健康對照組選自北華大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心，共30例，男15例，女15例，年齡36.47±9.87歲，近期無明顯皮膚病及過敏性疾病。

1.2標本采集

清晨空腹采集靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝。常溫下離心，3 500 r/min,10 min。分離血漿檢測，不能及時檢測的血漿標本置-70℃冰箱保存，一周內(nèi)檢測完畢。

1.3方法

1.3.1miRcute miRNA提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供。按試劑盒說明操作。

1.3.2miRNA 3＇末端進行加Ploy(A)尾 劑盒由北京天根生化科技有限公司提供，反應(yīng)液組成見表1。

表1　Poly(A)加尾處理反應(yīng)液體系

注：混勻，12 000 rpm離心30 s,37℃ 60 min

1.3.3cDNA合成按如下20 μl反應(yīng)體系配置見表2。

表2　合成cDNA反應(yīng)液體系

注：同上。

1.3.4實時熒光定量PCR檢測miRNA-155。PCR體系見表3。PCR條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，60℃34 s，共45個循環(huán)；熒光采集點設(shè)在60℃34 s末。PCR結(jié)束后，以0.05℃/sec的速度開始升溫，直到升高至94℃，做熔解曲線分析。

表3　PCR反應(yīng)液體系

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

PCR可以檢測記錄每個反應(yīng)管中每次循環(huán)所產(chǎn)生的熒光信號，將每次檢測到的熒光信號繪制成每個反應(yīng)管的擴增曲線，當熒光強度達到一定閾值時，PCR儀記錄下此時的循環(huán)數(shù)，以此為基礎(chǔ)可以得到每個樣本的Ct值。采用相對定量法進行分析，以U6作為內(nèi)參照，計算標本中miRNA-155的相對表達量。標本中的miRNA相對表達量的計算公式：RQ=2-△Ct，其中△Ct=CtmiR-155-CtU6。所得到的結(jié)果使用SPSS19.0軟件對所得結(jié)果進行分析，各組間的比較采用兩樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCR擴增曲線

圖1為miRNA-155的擴增曲線圖，曲線分為：熒光背景信號階段、指數(shù)擴增階段和平臺期。曲線為平滑的S型，說明操作準確，結(jié)果可信。

圖1　miRNA-155的擴增曲線圖

2.2熔解曲線分析

在以SYBR為染料的PCR反應(yīng)中，只要有雙鏈形成就會產(chǎn)生熒光。由于無法判斷PCR產(chǎn)生的熒光是否為特異性產(chǎn)物所發(fā)出的熒光，所以在反應(yīng)結(jié)束后需進行熔解曲線的分析。如圖2所示，熔解曲線圖僅有單一峰，而未出現(xiàn)多峰，表明擴增的目的基因為單一產(chǎn)物，未出現(xiàn)非特異性擴增，實驗結(jié)果可信。

圖2　熔解曲線

2.3各實驗組miRNA-155檢測結(jié)果分析

以U6作為內(nèi)參照，標本中的miRNA相對表達量按公式：RQ=2-△Ct計算，其中△Ct=CtmiR-155-CtU6。相對表達量取對數(shù)后進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表4。

表4　三組miRNA-155相對表達量統(tǒng)計表

①與濕疹組比較，P<0.05；②與正常對照組比較，P<0.01；③與正常對照組比較，P>0.05

3討論

miRNA是單鏈小RNA，雖然不能翻譯成蛋白質(zhì)，但是可以在轉(zhuǎn)錄后水平對蛋白質(zhì)編碼基因的表達進行調(diào)控。在細胞的增殖、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及器官的發(fā)育過程中均可發(fā)揮重要作用[6,7]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)miRNA與過敏性疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)。Sonkoly[8]對皮膚免疫性疾病相關(guān)的miRNA進行篩選，在初步篩選出來的29個miRNA分子中挑選出miR-203、miR-146a、miR-21及miR-125b進行擴大樣本量的檢測，最終證實了miR-203在銀屑病患者皮損中表達水平升高并且與健康對照組及過敏組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。在眾多miRNA當中，miR-155 是免疫系統(tǒng)最主要的miRNA 之一，在活化的各種免疫細胞中表達普遍升高，廣泛參與固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。過敏性皮膚病是臨床上常見的免疫相關(guān)性疾病，miR-155在過敏性皮膚病的發(fā)生發(fā)展中的作用如何，是近年的研究熱點。2010年，Sonkoly[9]等又發(fā)表了一篇關(guān)于miR-155在蕁麻疹中的表達特征的文章，研究結(jié)果證實miR-155在蕁麻疹患者中的表達與對照組相比顯著升高并有統(tǒng)計學(xué)意義。本文應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)定量檢測過敏性皮膚病中的和濕疹患者血漿中miRNA-155的相對表達量，以健康人作為對照組，研究miRNA-155檢測在過敏性皮膚病中的應(yīng)用價值。在應(yīng)用實時熒光PCR技術(shù)定量檢測miRNA-155的方法學(xué)研究中，通過全面評估PCR擴增曲線和熔解曲線，證實檢測結(jié)果準確，PCR產(chǎn)物特異。臨床應(yīng)用研究結(jié)果證實，蕁麻疹和濕疹患者血漿中miRNA-155的相對表達量均顯著高于對照組，此結(jié)果與Sonkoly[9]報道的結(jié)果一致。本文研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，蕁麻疹組血漿中miRNA-155的相對表達量高于濕疹患者組，此結(jié)果的臨床意義尚需擴大量進一步研究。

參考文獻：

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Application of miRNA-155 Detection with Fluorescence Quantitative PCR Technique in Allergic DermatosisLIYing，BILian-hongSONGYu-guo.(BeihuaUniversityAffiliatedHospital,Jilin132011，China)

Abstract:ObjectiveTo use Fluorescence Quantitative PCR technique to detect the relative content of the miRNA-155 in peripheral blood,and study the differences of the expression quantity of the miRNA-155 in peripheral blood between allergic dermatosis patients and normal controls.MethodsUse miRNA separation and purification box to extract miRNA from peripheral blood plasma,after reverse transcription of cDNA,use SYBR Green method to carry on the quantitative PCR test to detect the expression quantity of the miRNA-155 in peripheral blood among 40 cases of urticaria patients,30 cases of eczema patients and 30 cases of healthy controls.ResultsThe expression level of miRNA-155 in peripheral blood of urticaria patients was significantly higher than that of the control group (P<0.01) and was also higher than that of eczema patients (P<0.05).There is no significant difference of the miRNA-155 expression level between eczema patients and normal control group (P>0.05).ConclusionThe detection of the relative content of the miRNA-155 in peripheral blood with Fluorescence Quantitative PCR technique is conductive to the diagnosis of urticaria,laying an experimental foundation for further study of the pathogenesis of urticaria.

Key words:urticaria;miRNA;fluorescence quantitative PCR

(收稿日期：2015-05-14)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R758.2

文章編號：1007-4287(2015)12-2036-03

*通訊作者

基金項目:吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目(201339022)