王占偉，劉茂軍，王 麗，邵國青

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京210014）

WANG Zhan-wei，LIU Mao-jun，WANG Li，SHAO Guo-qing

（Institute of Veterinary Medicine，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology，Ministry of Agriculture/National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products，Nanjing 210014，China）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是豬上呼吸道的一種常在菌，也被認為是一種條件性致病菌，即在特定條件下可以侵入機體并引起嚴重的全身性疾病，稱為格拉澤氏?。℅lasser′s disease），該病呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的損失，尤其是在近10 多年的時間里?；贙ieletein-Rapp-Gabriedson（KRG）瓊脂擴散血清分型方法[1]，將Hps分為15 個血清型，另有20%～40%分離株的血清型不可定。以血清流行病學調(diào)查為主的結(jié)果顯示，國外主要流行血清4、5 型和13 型Hps[2-3]，國內(nèi)Hps 的流行情況與其型相似，以血清5 型和4 型為主，其次為血清12 型和13 型[4-5]。研究表明，毒力與血清型有一定關(guān)系，即血清1、5、10、12、13 型和14 型Hps的毒力最強，血清2、4 型和15 型Hps 的毒力次之，而血清3、6、7、8、9 型和11 型無毒力[6-7]。對于血清型較多的Hps，選擇一種合適的實驗動物作為攻毒模型，是進行防治研究的關(guān)鍵之一，目前，國內(nèi)外使用的實驗動物有SPF豬[8]、剖腹產(chǎn)未吃初乳（CDCD）豬[9]、自然分娩未吃初乳（NFCD）豬[10]、人工助產(chǎn)未吃初乳（SFCD）豬[11]，但由于其對于試驗條件的要求和成本均較高，使得其應用于實際研究有局限性。因此，很多學者已探索用豚鼠和Balb/c 小鼠作為替代動物模型[12-14]。本文將以豚鼠和Balb/c 小鼠為攻毒模型，評價Hps 分離株FS0307 株、XX0306 株和標準株HS1079 株的致病力。

1 材料與方法

1.1 菌株 Hps 血清4 型分離株FS0307 株、血清5 型分離株XX0306 株，由本所分離保存；血清13型標準株HS1079 株，由北京市農(nóng)林科學院惠贈。

1.2 動物 4 周齡的豚鼠、6 周齡Balb /c 小鼠，購自揚州大學實驗動物中心；自由采食和飲水。

1.3 材料 胰酶大豆瓊脂（TSA）和胰酶大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基（英國Oxioid 公司）；新生牛血清（蘭州民海）；NAD（國藥）；TSA、TSB 配制后添加10%新生牛血清和0.01% NAD。Hps 間接血凝（IHA）檢測試劑，本所制備。

1.4 菌株培養(yǎng) TSA 平板復蘇培養(yǎng)Hps 血清4 型分離株FS0307株、血清5型分離株XX0306株和血清13型標準株HS1079 株，挑取單菌落用TSB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 做為種子液，將種子液按培養(yǎng)基總體積的5%接種于TSB 液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，平板計數(shù)細菌；按所需濃度進行濃縮或稀釋。

1.5 Hps 對豚鼠的毒力 20 只豚鼠隨機分成4 組，其中，3 組攻毒組，每組5 只；1 組對照組，5 只。3 組攻毒組分別用Hps FS0307 株、XX0306 株和HS1079株通過腹腔接種，每只1 mL（5×109CFU）。對照組腹腔注射生理鹽水，每只1 mL。攻毒后每天觀察并記錄豚鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況，直到第10 天。對所有死亡和10 d 后未死亡豚鼠進行剖檢，觀察并記錄各組織器官的病變，同時無菌取腹腔液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行細菌的分離，以確認Hps 的感染，并用Hps IHA 試劑檢測血清抗體。

1.6 Hps 對小鼠的毒力 取20 只Balb/c 小鼠，隨機分為4 組，3 組攻毒組和1 組對照組，每組5只。3 組攻毒組分別用Hps FS0307 株、XX0306 株和HS1079 株通過腹腔接種，每只0.5 mL（1×109CFU）。對照組腹腔注射生理鹽水，每只0.5 mL。感染后臨床觀察10 d，記錄小鼠的臨床表現(xiàn)和死亡情況，對死亡小鼠和10 d 后耐過的小鼠進行剖檢，觀察并記錄各組織器官的病變，無菌取腹腔液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟接種TSA 平板進行Hps 再分離，并用Hps IHA 試劑檢測血清抗體。

2 結(jié)果

2.1 感染結(jié)果 Hps 感染豚鼠10 h 內(nèi)，開始出現(xiàn)呼吸加快、精神沉郁、被毛粗亂等癥狀，且10 h 后開始死亡，若3 d 內(nèi)未死亡的豚鼠，則耐過存活。連續(xù)觀察10 d 后的結(jié)果見表1。剖檢發(fā)現(xiàn)，死亡豚鼠均發(fā)現(xiàn)多臟器有出血。

表1 豚鼠感染結(jié)果

Hps 感染小鼠3 h 后，開始出現(xiàn)精神沉郁、厭食、震顫、背毛豎立、扎堆、不運動等臨床表現(xiàn)，且24 h 后開始死亡，若3 d 內(nèi)未死亡的小鼠，則耐過存活。連續(xù)觀察10 d 后的結(jié)果見表2。剖檢發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)S0307 株攻毒組和XX0306 株攻毒組死亡的1只小鼠的腹腔有輕微粘連。

表2 小鼠感染結(jié)果

2.2 Hps 再分離結(jié)果 無菌取所有死亡、存活豚鼠的腹腔液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行分離Hps。結(jié)果顯示，F(xiàn)S0307 株攻毒組、XX0306 株攻毒組、HS1079 株攻毒組和對照組的實驗豚鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官均未分離出Hps；而除了對照組和HS1079 株攻毒組存活的1 只豚鼠外，3組攻毒組豚鼠的腹腔液均分離到Hps。

無菌取各組死亡和存活小鼠的腹腔液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行分離Hps。結(jié)果顯示，F(xiàn)S0307 株攻毒組、XX0306 株攻毒組、HS1079株攻毒組和對照組的實驗小鼠的腹腔液、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官均未分離出Hps。

2.3 血清抗體的IHA 檢測結(jié)果 取各組死亡和未死亡的豚鼠、小鼠的血液，IHA 檢測血清抗體。結(jié)果顯示，Hps 感染的各組小鼠、豚鼠的血清抗體均為陰性。

3 分析與討論

Hps 一般出現(xiàn)在混合感染的病例中，因此學者們通常認為Hps 是某些疫?。ㄈ鏟CV2 感染、Mhp 感染或PRRSV 感染）的繼發(fā)病原，其原因是PCV2 或PRRSV 能誘導感染動物免疫抑制，為細菌的繼發(fā)創(chuàng)造條件[15-16]，因此單獨感染或者用普通豬來作實驗動物感染，成功的幾率很低。本文以豚鼠和Balb/c小鼠作為替代攻毒模型動物進行試驗，從臨床癥狀結(jié)果可知，Hps 血清4 型分離株FS0307 株、血清5 型分離株XX0306 株和血清13 型標準株HS1079 株均能引起小鼠和豚鼠100%發(fā)病，說明3 個血清型的菌株的毒力均較強，與Kielstein 等[1]和Oliveira 等[10]報道的基本一致；而且2 株分離菌株對豚鼠的致死率達到100%，對小鼠的致死率為20%；而標準株對豚鼠的致死率也達到80%，不致死小鼠，說明分離株的致病力強于標準株，且豚鼠對Hps 的敏感性強于小鼠。在選用何種動物作為攻毒模型動物時，動物的敏感程度是首先要考慮的，再結(jié)合實驗的穩(wěn)定性及其他因素綜合評價，從而確定模型動物。根據(jù)已有報道[13]，以及本試驗的結(jié)果，相比較而言，豚鼠更適合作為Hps 的攻毒模型動物。

在Hps 攻毒后進行再分離過程，由于死亡或者健活的小鼠和豚鼠均無腹腔液，故采用無菌生理鹽水沖洗腹腔的方法制備腹腔沖洗液，再用其進行分離和鑒定。分離結(jié)果說明，從小鼠和豚鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和存活動物的腹腔沖洗液不容易再次分離到Hps，這與賀云霞等[14]的結(jié)論基本一致，而與李雪松等[17]在小鼠肺臟、脾、心血中分離到Hps 的結(jié)果不一致。但在接種Hps 后很快死亡的豚鼠腹腔沖洗液中可分離到Hps，有可能是有部分活菌還存留在腹腔中。從Hps 感染各組小鼠、豚鼠的血清抗體均為陰性的結(jié)果，猜測有兩個因素：一是IHA 的敏感性較低；二是感染動物本身還未產(chǎn)生抗體或者產(chǎn)生的抗體效價還很低。

本研究以經(jīng)典的實驗動物-豚鼠和Balb/c 小鼠為模型，評價了Hps 血清4 型分離株FS0307 株、血清5 型分離株XX0306 株和血清13 型標準株HS1079 株的毒力，這不僅為Hps 的攻毒模型提供了依據(jù)，也為副豬嗜血桿菌病疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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