李亞璞，劉玲君，宋曉青，吳 萌，程 華，李春生（.河北省科學(xué)院生物研究所，河北 石家莊 05008；.河北三元食品有限公司，河北石家莊 050073）

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牛乳鐵蛋白抗體的制備及其特性測定

李亞璞1，劉玲君2，宋曉青2，吳 萌1，程 華1，李春生1
（1.河北省科學(xué)院生物研究所，河北 石家莊 050081；2.河北三元食品有限公司，河北石家莊 050073）

摘 要：利用BLF抗原免疫BALB/c小鼠，采用常規(guī)細(xì)胞融合技術(shù)制備了6株抗BLF的單克隆抗體細(xì)胞株，并用此抗原免疫新西蘭大白兔獲得了55 mL的兔多抗血清。針對腹水單抗及多抗血清進行了一系列特性分析，結(jié)果顯示，5株抗體效價基本上在1∶106以上；間接ELISA測定6株抗體與酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白基本無交叉反應(yīng)，抗體特異性良好；抗體為IgG1亞類，2B12抗體親和力優(yōu)于其他抗體。多抗血清效價可達到1∶107以上，抗體也具有一定的特異性。

關(guān)鍵詞：牛乳鐵蛋白；單克隆抗體；多克隆抗體；特性

乳鐵蛋白（lactoferrin，簡稱LF）是乳汁中一種重要的非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，分子量為80 kDa[1]。LF是人乳中的4種主要蛋白質(zhì)之一，約占人乳總蛋白的20％，人乳與牛乳在初乳期LF的含量最高，而到常乳期降到最低。在常乳期，牛乳中LF含量較母乳低很多。LF具有抗菌抑菌性[2-3]、抗病毒[4]、促進鐵元素的吸收和鐵的平衡[5]、抑制腫瘤細(xì)胞生長及調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)[6-7]等多種生理功能。在嬰幼兒配方奶粉中強化LF使?fàn)I養(yǎng)成分接近母乳，對嬰幼兒的營養(yǎng)需求和生長發(fā)育極其重要，因此在奶粉中添加牛乳鐵蛋白（簡稱BLF）是當(dāng)今發(fā)展的趨勢。

BLF的檢測方法主要有高效液相色譜法、電泳法和酶聯(lián)免疫吸附法[8-10]。高效液相色譜法是目前國內(nèi)測定BLF使用最多，也最權(quán)威的方法，但檢測成本高；電泳法結(jié)果準(zhǔn)確，但是檢測時間長，操作繁瑣。酶聯(lián)免疫吸附法可用于大規(guī)模樣品的檢測和篩選，為適應(yīng)現(xiàn)代檢測快速、簡捷、現(xiàn)場化的要求，也是國際認(rèn)可的檢測BLF的方法之一。試驗通過細(xì)胞融合技術(shù)，免疫小鼠制備了6株抗BLF的單克隆抗體，免疫新西蘭大白兔制備了抗BLF的多克隆抗體，為開發(fā)BLF雙抗體夾心的免疫檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試動物為BALB/c小鼠、新西蘭大白兔，均購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

試驗試劑主要有牛乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，純度98％，日本進口分裝；DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購自北京；新生牛血清購自蘭州；乳白蛋白、β-乳球蛋白、HAT、HT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、PEG4000、免疫球蛋白亞型試劑盒、牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白、甘油、吐溫-20等（Sigma公司）。

1.2試驗方法

1.2.1抗原的制備 在天平上準(zhǔn)確稱取BLF標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶于10 mL超純水中，150 μL/管進行分裝，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2動物免疫 （1）小鼠免疫：選取3只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，將BLF抗原用生理鹽水稀釋，加入等體積的佐劑進行乳化，頸背部皮下多點注射，免疫抗原量為50 μg/只，首次免疫用弗氏完全佐劑，以后的免疫用弗氏不完全佐劑，每隔2周加強免疫一次，3次免疫后10 d斷尾取血，間接ELISA檢測小鼠血清抗體效價，選取最佳免疫小鼠進行融合。（2）新西蘭大白兔免疫：免疫新西蘭大白兔1只，免疫劑量500 μg/只，3次免疫后耳緣靜脈取血，離心取上清液初步測定抗血清效價，然后接著進行第4次和第5次免疫，測定血清效價有無變化，若無變化即可取血，所得血清即為抗BLF多克隆抗體。

1.2.3血清效價測定 常規(guī)間接ELISA法測定血清效價：①包被：用包被緩沖液將BLF抗原稀釋為1 μg/ mL，然后向每個酶標(biāo)板孔中加入100 μL抗原液，4℃放置酶標(biāo)板，過夜。②取出所用數(shù)量的酶標(biāo)板條，洗滌甩干后，加入封閉液，200 μL/孔，37℃溫箱避光孵育2 h。③洗板后加入待測血清：用洗液將待測血清倍比稀釋成1∶200、1∶400，共計稀釋23孔，最后1孔加入洗液作為空白對照，每孔中加入100 μL樣品，置于溫箱孵育45 min。④洗板后加入用封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，每孔中加入100 μL酶標(biāo)二抗，溫箱中孵育30 min。⑤洗板后加入底物顯色液，每孔中加入100 μL顯色液，溫箱中孵育10～15 min。⑥每孔50 μL加入2 mol/L H2SO4，終止反應(yīng)。⑦在酶標(biāo)儀下讀數(shù)，檢測波長450 nm，檢測孔OD值記為P，對照孔OD值記為N，以P/N≥2.1作為待測血清的效價。

1.2.4細(xì)胞融合 選取免疫效果及狀態(tài)最佳的小鼠進行細(xì)胞融合，采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法，制備腹水抗體。

1.2.5抗體的純化 單抗腹水采用辛酸-硫酸銨法進行純化，多抗血清采用飽和硫酸銨法進行純化，蛋白濃度測定采用ND-2000微量紫外分光光度計進行測定。

1.2.6抗體的特性測定 采用間接ELISA方法測定抗體效價，抗體亞型使用抗體亞型測定試劑盒進行測定，抗體的親和力測定參考文獻[11]。將包被抗原換為乳中其他幾種主要蛋白：酪蛋白、乳白蛋白及β-乳球蛋白包被酶標(biāo)板，間接ELISA方法進行免疫交叉測定。

1.2.7多克隆抗體的特性測定 多克隆抗體的特性測定主要包括抗體的效價測定及抗體的特異性測定。

2　結(jié)果與分析

2.1免疫小鼠血清效價測定

間接ELISA方法測定結(jié)果如表1，1號小鼠的效價為1∶8.2×105，2號小鼠和3號小鼠的效價均為1∶4.1×105，并且1號小鼠的狀態(tài)活潑，因此試驗選取1號小鼠準(zhǔn)備細(xì)胞融合。

表1　免疫小鼠效價測定

2.2抗BLF單克隆抗體細(xì)胞株的建立及抗體的制備

細(xì)胞融合約7 d，在顯微鏡下觀察具有克隆的孔達到了292孔，融合率為76％，并將這些克隆孔的培養(yǎng)上清采用間接ELISA方法進行了測定，從中選取了15孔OD值較高并且細(xì)胞狀態(tài)較好的單克隆孔進行了多次亞克隆篩選，最終得到了3A5、3H3、2B11、2B12、2E2和3D7共計6株能夠穩(wěn)定分泌抗體的單克隆細(xì)胞株，并對這些細(xì)胞株進行了擴大培養(yǎng)和液氮凍存。采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法，對6株細(xì)胞株進行了抗體的制備，最后每株細(xì)胞均得到了約20 mL的腹水抗體。

2.3單克隆抗體的特性測定

2.3.1單克隆抗體的效價及特異性測定 分別以BLF標(biāo)準(zhǔn)品、酪蛋白、乳白蛋白及β-乳球蛋白包被酶標(biāo)板，包被濃度1 μg/mL，第1孔抗體以1∶200進行，之后依次進行倍比稀釋，共計稀釋11孔，最后1孔空白對照。3A5、2B11、2B12和3D7四株抗體效價為1∶6.6×106，2E2抗體效價為1∶8.2×105，3H3抗體效價為1∶1.6×106，而6株抗體與其他幾種蛋白基本上無交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.3.2單克隆抗體的亞型測定 對6株抗BLF抗體進行亞型測定如圖1，測定數(shù)據(jù)顯示6株抗體與IgG1反應(yīng)較大，OD450值均在3.0以上，與IgM有較微弱的反應(yīng)，而與IgG2a、gG2b、IgG3和IgA基本上無反應(yīng)，因此該6種抗體亞型均為IgG1型。

2.3.3單抗的相對親和力測定 根據(jù)公式計算6株單抗的相對親和力測定結(jié)果為：2B12>3H3>2B11>3A5> 3D7>2E2。

2.3.4抗體的純化 采用辛酸-硫酸銨法對腹水進行純化，經(jīng)過純化后3H3、3A5、2B11、2B12、2E2和3D7共6株抗體的蛋白濃度分別為9.83、10.28、6.72、12.53、7.41和10.95 mg/mL。

圖1　單克隆抗體亞型測定

2.3.5多克隆抗體的特性測定 經(jīng)過5次免疫，采血，經(jīng)過離心約得55 mL多抗血清。間接ELISA法測定兔多抗血清的效價結(jié)果如表2顯示，BLF抗原對新西蘭大白兔的免疫效果很好，免疫效價達到了1∶1.3×107。間接ELISA法測定兔多抗的交叉反應(yīng)如所示，分別為酪蛋白、乳白蛋白和β-乳球蛋白包被，由圖1可知該多抗血清與其他3種蛋白有較微弱的交叉反應(yīng)，該多抗血清具有一定的特異性。將多抗血清經(jīng)過飽和硫酸銨法純化后凍干，部分凍干粉經(jīng)過稀釋測定蛋白濃度為50 mg/mL，分裝備用。

表2　兔多抗血清特異性測定

3　結(jié)果與分析

試驗抗原為大分子蛋白，因此選擇了常規(guī)免疫方法，經(jīng)過3次免疫后，供試小鼠及新西蘭大白兔的免疫效果達到了1∶106以上，然后又分別對其進行了加強免疫，最后得到了效價很高的抗BLF的單抗血清及多抗血清。

影響細(xì)胞融合效果的因素很多，如SP2/0細(xì)胞的生長狀況、SP2/0細(xì)胞與小鼠免疫脾細(xì)胞的比例等。其中，SP2/0細(xì)胞株是細(xì)胞融合成功的關(guān)鍵之一，試驗選擇的SP2/0細(xì)胞是處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，這時細(xì)胞活性最強，生命最旺盛，大小均一、渾圓透亮。免疫脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的比例一般是8∶1到10∶1之間融合效率比較高。試驗按8∶1進行融合，細(xì)胞融合率達到了76％。細(xì)胞融合后要及早進行抗體檢測和克隆化培養(yǎng)，經(jīng)過大約7～9 d，通過顯微鏡觀察，若細(xì)胞集落生長到整個視野的1/5～1/3時，就可以進行檢測。在進行亞克隆篩選的過程中，應(yīng)同時進行培養(yǎng)上清的交叉反應(yīng)測定，這樣就可以保證篩選所得的細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體具有一定的特異性。試驗經(jīng)過4次亞克隆篩選，得到了6株能穩(wěn)定分泌抗體且質(zhì)量好的抗BLF的單克隆抗體細(xì)胞株，分別為3H3、3A5、2B11、2B12、2E2和3D7。綜合比較，以2B12抗體親和力最高，因此選取其用于下一步的雙抗體夾心試驗。

多抗血清的效價及其特異性主要取決于抗原的純度。試驗所用BLF抗原標(biāo)準(zhǔn)品為日本進口分裝，抗原純度在98％以上，因此保證了所獲得抗血清的特異性。試驗對該多抗血清進行了飽和硫酸銨純化，所獲抗體蛋白濃度為50 mg/mL，交叉反應(yīng)測定結(jié)果顯示，該抗體與牛乳中其他主要蛋白有微弱的交叉反應(yīng)，可用于以后的雙抗體夾心試驗。

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（責(zé)任編輯：夏亞男）

Preparation and Characteristics of Antibodys against Bovine Lactoferrin

LI Ya-pu1，LIU Ling-jun2，SONG Xiao-qing2，WU Meng1，CHENG Hua1，LI Chun-sheng1
（1.Institute of Biology, Hebei Academy of Sciences, Shijiazhuang 050081, PRC; 2.Hebei Sanyuan Foods Co., Ltd., Shijiazhuang 050073, PRC ）

Abstract：Six strains of monoclonal antibody (McAb) cells against bovine lactoferrin (BLF) were obtained with BLF antigen immune BALB/c mice by the hybridoma cells technique, and the six McAbs were detected on the antibody titer, specificities and relative affinity; the BLF antigen was used with injection to immunize the New Zealand white rabbit so as to get 55 mL of rabbit polyclonal antibody (PcAb) serum; and the ascites fluid McAb and PcAb sera were analyzed on a series of characteristics in this study.The results showed that the titer of five of the six McAbs was basically over 1∶106; the six McAbs with good antibody specificity were of almost no cross reactivities with other proteins in milk, such as casein, lactalbumin and β-lactoglobulin, by the indirect ELISA; and the antibody in IgG1 subclass was, of higher 2B12 antibody affinity than other antibodies.The PcAb serum could be of the titer of over 1∶107, and the PcAb was of a certain specificity, i.e.low reactivities with casein, lactalbumin and β-lactoglobulin.

Key words：bovine lactoferrin; monoclonal antibody; polyclonal antibody; characteristic

作者簡介：李亞璞（1980-），女，河北石家莊市人，助理研究員，主要從事免疫檢測技術(shù)研究。

基金項目：河北省科學(xué)院基金項目（15305）

收稿日期：2015-11-09

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.12.002

中圖分類號：R392

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-060X（2015）12-0005-03