武玉珍,馮睿芝,張 峰

1 晉中學院生物科學與技術學院，晉中 030619 2 復旦大學生物醫(yī)學研究院，上海 200032 3 山西大學生命科學院，太原 030006

基于ISSR分子標記的褐馬雞親緣關系分析

武玉珍1,馮睿芝2,張 峰3,*

1 晉中學院生物科學與技術學院，晉中 030619 2 復旦大學生物醫(yī)學研究院，上海 200032 3 山西大學生命科學院，太原 030006

褐馬雞(Crossoptilonmantchuricum)是中國特有瀕危鳥類，國家一級保護動物。為了保護褐馬雞種質資源，保障馴養(yǎng)繁育種群和再引入種群的遺傳基因結構優(yōu)化，采用 ISSR分子標記技術，對山西龐泉溝國家自然保護區(qū)和太原動物園兩個種群35個褐馬雞進行了親緣關系分析。從20條ISSR引物中篩選出10條擴增條帶清晰穩(wěn)定、重復性好的引物，共擴增出65條DNA條帶，其中 77%呈多態(tài)性。兩個種群各個體之間的Nei′s無偏差遺傳距離和遺傳相似度分析表明：個體間遺傳相似性的平均值分別為0.5061與0.7591，遺傳距離的平均值分別為0.4939與0.2409。用組平均法對35個褐馬雞個體進行聚類分析，結果顯示：大多數(shù)同一種群的個體首先聚在一起，顯示出生態(tài)地理條件相似的種群親緣關系較近。

褐馬雞；ISSR；遺傳距離；遺傳相似度；聚類分析；親緣關系

褐馬雞(Crossoptilonmantchuricum)為中國特有珍稀鳥類，國家一級保護動物，世界瀕危物種。目前褐馬雞只分布在中國華北的部分地區(qū)，由于太行山和黃河的阻隔，褐馬雞的棲息地被分割成三塊孤立的自然地理區(qū)域，形成了三個獨立的褐馬雞種群，即山西呂梁山的中部種群、河北小五臺山與北京東靈山的東部種群、陜西黃龍山的西部種群。山西省是褐馬雞分布中心和多度中心。長期以來，對于褐馬雞的研究主要集中在生物學、生態(tài)學、資源調(diào)查及保護等方面[1- 3]，近年來以分子生物學技術進行褐馬雞遺傳多樣性方面的研究[4- 7]有少量報道，表明對褐馬雞的研究開始從宏觀進入微觀分子水平。但采用ISSR分子標記對褐馬雞親緣關系的研究目前尚未見報道。ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats)是Zietkiewicz等[8]于1994年創(chuàng)建的一種新的分子標記技術，它是根據(jù)基因組中廣泛存在的微衛(wèi)星序列，設計通用引物對基因組DNA進行PCR擴增，從而檢測基因組中微衛(wèi)星序列的變異。ISSR結合了SSR和 RAPD 的優(yōu)點，操作簡單、穩(wěn)定性好、檢測方便，近年來廣泛應用在種群遺傳多樣性[9- 10]、種質資源鑒定[11- 12]、親緣關系[13- 14]和系統(tǒng)發(fā)育[15]等方面的研究。

本文采用ISSR分子標記技術，對山西龐泉溝國家自然保護區(qū)和太原動物園的兩個褐馬雞種群的35個個體進行親緣關系分析, 旨在了解這兩個分別代表山西野生種群和籠養(yǎng)種群褐馬雞的遺傳背景和種質潛質，為保護褐馬雞種質資源和褐馬雞的野外放歸與再引入提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料：龐泉溝褐馬雞樣品18份，其中肌肉樣品3份，采自龐泉溝保護區(qū)繁育場死亡幼雛；血液樣品15份，采自保護區(qū)繁育場混養(yǎng)的成年褐馬雞。太原動物園血液樣品17份，均采自動物園籠養(yǎng)種雞，實驗樣品共35份。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

分別取 0.34g肌肉、10—70 μL的血液，采用常規(guī)的SDS/蛋白酶K裂解, 酚/氯仿法提取基因組總DNA，詳細操作參照武玉珍[16]文獻。

1.2.2 ISSR引物的篩選

依據(jù)加拿大不列顛哥倫比亞大學(UBC)公布的第9套ISSR引物序列，參照Abbot[17]與白秀娟[18]的研究結果，選擇其中的20條引物(表1)，均由北京奧科公司合成。通過4個隨機樣本的選擇，從20條ISSR引物中篩選出10條擴增產(chǎn)物穩(wěn)定、條帶清晰、重復性好的引物，再對全部材料進行PCR擴增。

1.2.3 ISSR-PCR擴增

在25μL反應體系中含有10×PCR Buffer 2.5μL、25mmol/L Mg2+2μL、1.25 mmol/L dNTP 4μL、5.0 μmol/L引物5.0μL、2 U/μL Taq酶0.5μL、10 ng—150 ng/μL DNA模板1 μL，余量由ddH2O補足，在PTC- 150 PCR儀上進行擴增。PCR反應條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，退火溫度38—54 ℃ 45 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，最后72 ℃延伸7min。每條引物的PCR反應退火溫度見表1。

表1 ISSR引物序列Table 1 ISSR primer sequences

1.2.4 電泳檢測

PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，DNA marker為DL2000 (購自大連寶生物公司)，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，并記錄電泳結果。

圖1 引物ISSR 811對太原動物園1—10號樣品擴增的指紋圖譜Fig.1 Profile of the Brown-eared pheasant from Taiyuan Zoo by primer 811

1.2.5 譜帶分析

ISSR擴增譜帶以 0、1數(shù)據(jù)統(tǒng)計，在同一引物，同一位點，根據(jù)擴增產(chǎn)物的有(1)無(0)得到二元資料，形成ISSR分析的原始數(shù)據(jù)矩陣(0，1)矩陣。利用PhylTools6.0軟件計算兩個種群各個體之間的Nei′s無偏差遺傳距離和遺傳相似度，應用組平均法對褐馬雞35個個體的(0，1)原始矩陣進行聚類分析，得到聚類結果。

2 研究結果

2.1 ISSR擴增圖譜

本實驗中共試驗了20 條ISSR 引物, 其中10條可擴增出清晰條帶, 將其用于供試35個樣本PCR擴增，引物編號分別為806、807、808、809、811、812、815、816、817和818，除806外，引物的退火溫度在50℃以上, 保證了PCR 反應較高的特異性。10條引物共擴增出65條清晰穩(wěn)定的條帶，擴增片段大小在300—2000bp之間，每個引物擴增的位點從5到9不等，平均為6.5，65個擴增位點中有50個位點具有多態(tài)性，多態(tài)性位點比率為76.9%。引物對部分樣品的擴增結果見圖1—圖3。

圖2 引物ISSR 811擴增的太原動物褐馬雞11—17號樣和龐泉溝12、13樣品的指紋圖譜Fig.2 Profile of the Brown-eared pheasant from Taiyuan Zoo and Pangquangou Nature Reserve by primer 811

圖3 引物ISSR811擴增的龐泉溝自然保護區(qū)褐馬雞樣品的指紋圖譜Fig.3 Profile of the Brown-eared Pheasant of Pangquangou Natural Reserve using primer 811

2.2 遺傳距離與遺傳相似系數(shù)

利用PhylTools軟件計算出了褐馬雞兩個種群各個體之間的Nei′s遺傳距離(表2和表3)、遺傳相似系數(shù)(表4和表5)。

從表2可以看出：太原動物園17個個體間的遺傳距離為0.0000—0.5348，平均值為0.2409。其中，dwy8與dwy6之間遺傳距離最大為0.5348，其次是dwy1與 dwy10間為0.5000，而dwy7與dwy2，dwy9與dwy5，dwy12分別與dwy5、dwy9，dwy13與dwy3，dwy14分別與dwy3、dwy13，dwy16與dwy15，dwy17與dwy4間遺傳距離為0.0000。

表2 太原動物園17只褐馬雞之間的Nei′s 遺傳距離Table 2 Nei′s Genetic distance of the 17 individuals of Brown-eared pheasant from Taiyuan Zoo

1—17 分別為：dwy 1—17 號個體

從表3可以看出：龐泉溝保護區(qū)18個個體間的遺傳距離在0.000—1.000之間，平均值為0.4939。其中，pqg2與pqg5、pqg 8、pqg14—18，pqg3與pqg5，pqg4與pqg5、pqg 8、pqg14—18，pqg5與pqg8、pqg12，pqg7與pqg11，pqg8與pqg11，pqg11與pqg16遺傳距離最遠為1.0000；其次是pqg10與pqg2、pqg4以及pqg9與pqg11間遺傳距離為0.8182；而pqg4與pqg2、pqg12與pqg3、pqg15與pqg14遺傳距離最近為0.0000。

表3 龐泉溝自然保護區(qū)18只褐馬雞之間的Nei′s 遺傳距離Table 3 Nei′s Genetic distance of the 18 individuals of Brown-eared pheasant from Pangquangou Nature Reserve

1—18 分別為：pqg 1—18 號個體

從表4可以看出：太原動物園種群中，dwy7與dwy2，dwy9與dwy5，dwy12分別與dwy5、dwy9，dwy13與dwy3，dwy14分別與dwy1、dwy4，dwy16與dwy15，dwy17與dwy4之間遺傳相似度最高為1.0000，遺傳距離最近；而dwy8與dwy6之間遺傳相似度最低為0.4615，遺傳距離最遠。

表4 太原動物園17只褐馬雞之間的Nei′s 遺傳相似系數(shù)Table 4 Nei′s Genetic similarities of 17 individuals of Brown-eared pheasant of Taiyuan Zoo

1—17 分別為：dwy 1—17 號個體

從表5可以看出：龐泉溝自然保護區(qū)種群中，pqg4與pqg2，pqg12與pqg3，pqg15與pqg14遺傳相似度最高為1.0000，遺傳距離最近；而pqg2、pqg4分別與pqg5、pqg8、pqg14、pqg15、pqg16、pqg17、pqg18，pqg5分別與pqg3、pqg8、 pqg12，pqg11與pqp8、pqg7，遺傳一致度最低為0.0000，遺傳距離最遠。

表5 龐泉溝自然保護區(qū)18只褐馬雞之間的Nei′s 遺傳相似系數(shù)Table 5 Nei′s Genetic similarities of 18 individuals of Brown-eared pheasant of Pangquangou Nature Reserve

1—18 分別為：pqg 1—18號個體

2.3 親緣關系聚類圖

應用組平均法對褐馬雞35個個體的(0，1)原始矩陣進行聚類分析，結果見圖4。從圖4看出：35個個體聚為3類，其中24(pqg7)為單獨一類；太原動物園除dwy7外，其它個體聚為一類；龐泉溝自然保護區(qū)的個體聚為一類。大多數(shù)同一種群的不同個體首先聚在一起，顯示出明確的生態(tài)地理條件相似的種群優(yōu)先相聚，也就是說生態(tài)地理條件相似的種群親緣關系較近。pqg7顯示出與兩個種群的其他個體親緣關系相對較遠；dwy6與動物園種群的其他個體親緣關系相對較遠；dwy7顯示出與龐泉溝種群具有較近的親緣關系。

圖4 用Between-groups linkage法構建的褐馬雞兩個種群35個個體的ISSR聚類圖Fig.4 ISSR dendrogram of 35 individuals from two populations of Brown-eared pheasant using Between-groups linkage

3 分析與討論

3.1 ISSR實驗的穩(wěn)定性

要獲得一個物種不同種群的遺傳背景信息，必需檢測大量的樣本，檢測方法的穩(wěn)定性也是非常重要的。ISSR引物一般是由17bp的堿基組成，對基因組DNA具有快速、高效、靈敏的檢測特性，而且可重復性好，操作簡便、成本較低，實驗的穩(wěn)定性較高[19]。由于ISSR的穩(wěn)定性受Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度等因素的影響，因此，進行ISSR大量樣本的擴增前，先對ISSR反應的條件進行了優(yōu)化，采用統(tǒng)一的PCR反應條件。對20條ISSR引物進行了篩選，其中有10條引物能擴增出條帶清晰且具多態(tài)性的帶型。在這10條引物中(AG)n與(CA)n各有3條，(GA)n有2條，說明褐馬雞基因組中存在大量的(CA)、(AG)二核苷酸重復序列。在引物篩選的過程中，退火溫度較高的引物擴增效果均較退火溫度低的好，篩選出所選用的10條引物只有1條退火溫度較低，其它9條引物退火溫度均較高。在ISSR圖譜中出現(xiàn)某種群的特征條帶，引物815的擴增圖譜只有龐泉溝種群的個體出現(xiàn)大于1000 bp 的片段，引物811、812、809對龐泉溝自然保護區(qū)種群的擴增有特異性。引物811可以將這35個個體區(qū)分開。因此，只要引物選擇合適，擴增出種群的特征性譜帶，有助于種群的遺傳結構分析，為進一步克隆、測序，尋找種群特有的分子標記提供了可能。

應用mtDNA標記和ISSR標記兩種方法，對這兩個褐馬雞種群進行了遺傳多樣性的研究[5,7]，二者的結果基本一致，這表明無論用線粒體DNA標記(mtDNA)，還是細胞核DNA標記(ISSR)，研究的結果基本相同，可以互為印證。這說明ISSR標記是一種研究種群遺傳多樣性、遺傳結構、種質資源及親緣關系的穩(wěn)定有效工具。

3.2 親緣關系分析

山西龐泉溝國家自然保護區(qū)與太原動物園兩個褐馬雞種群個體間遺傳相似性的平均值分別為0.5061與0.7591，遺傳距離的平均值分別為：0.4939與0.2409，35只褐馬雞個體總的Nei′s遺傳距離和相似性系數(shù)平均值分別為：0.3723和0.6310。分析表明兩個種群的遺傳變異有差異，但差異未達到統(tǒng)計學顯著性水平，兩個種群個體之間親緣關系較近。聚類分析結果表明：遺傳距離較近的個體聚在一起，然后與遺傳距離較遠的個體再聚。遺傳距離較近的個體親緣關系近，而遺傳距離較遠的個體，親緣關系較遠。大多數(shù)同一種群的不同個體首先聚在一起，顯示出生態(tài)地理條件相似的種群優(yōu)先相聚，但也存在不同種群聚在一起的情況。如圖4中pqg7單獨聚為一類，顯示出與兩個種群親緣關系較遠，推測可能是來自保護區(qū)分布較遠的不同種群的后代。圖4中dwy7與龐泉溝種群聚為一類，顯示出與龐泉溝種群有較近的親緣關系，推測這兩個褐馬雞種群可能具有共同的親源。這一結論與太原動物園飼養(yǎng)褐馬雞的歷史相符合。太原動物園1959年由蘆芽山(寧武縣)提供褐馬雞種源，開始試驗人工飼養(yǎng)，曾經(jīng)4次較大數(shù)量補充野生種源，1979—1983年從蘆芽山補充60余只，1992年和2014年分別從龐泉溝自然保護區(qū)補充野生種源8只、6只，2011年從蘆芽山補充野生卵孵化9只。到2000年建成了全國最大的褐馬雞人工飼養(yǎng)繁育基地，為全國各地動物園提供褐馬雞種源和觀賞雞。

兩個種群遺傳相似性和遺傳距離的差異(表2—表5)，反應出兩個種群飼養(yǎng)方式的不同。龐泉溝自然保護區(qū)的個體間遺傳相似性的平均值低于太原動物園，遺傳距離的平均值高于太原動物園，說明龐泉溝種群個體間的親緣關系較遠，動物園種群個體之間的親緣關系較近。這種狀況與兩個種群不同的飼養(yǎng)方式有關。龐泉溝自然保護區(qū)繁育場采取仿野生的散養(yǎng)、混養(yǎng)方式，并且每年從保護區(qū)野外撿拾褐馬雞卵進行孵化補充種群，繁育場的種群雖然有可能近親繁殖，但因為不斷有新種源補充，群體的親緣關系仍較遠。太原動物園從1996年起選配12對成年褐馬雞實行“一夫一妻”的分籠配對繁殖飼養(yǎng)，這種方式有效避免了近交繁殖，但是種源有限，更新也較慢，群體的親緣關系仍比較近。因為飼養(yǎng)的用途不同，所采取的飼養(yǎng)方式也不同。

本試驗對褐馬雞兩個種群35個個體進行遺傳距離聚類及親緣關系分析，可作為優(yōu)質種源和再引入親本選擇時的理論依據(jù)。作為親本應盡量選擇遺傳距離大于0.5的組合，同時避免遺傳距離小于 0.25的親本組合。可重點選擇龐泉溝自然保護區(qū)野生種群的pqg2、pqg4分別與pqg5、pqg8、pqg14、pqg15、pqg16、pqg17、pqg18，pqg5與pqg3、pqg8、 pqg12，pqg11與pqp7、pqg8等，這些個體之間遺傳相似性最低(0.0000)，遺傳距離最遠(1.0000)，親緣關系最遠，可以作為優(yōu)質親本種源。

3.3 ISSR標記在野生動物研究中的應用前景

ISSR標記常用作一種植物(農(nóng)作物、藥材等)多個品種、品系之間親緣關系的區(qū)分和鑒定。但野生動物個體之間外部形態(tài)差異不大，親緣關系主要與生態(tài)地理環(huán)境有關，特別是像褐馬雞這種飛行能力較差的地棲鳥類。應用ISSR標記技術可以有效分辨動物個體之間的親緣關系，同時可以篩選出親緣關系較遠的個體，如獨自聚為一類的pqg7個體(圖4)，作為人工飼養(yǎng)繁育的優(yōu)質種源和褐馬雞再引入的原始種源。棲息地的破碎化致使我國的褐馬雞被分割為3個孤立種群(山西、河北、陜西)，各種群之間因地理阻隔難有基因交流，遺傳多樣性較低[5,7]。以ISSR標記研究褐馬雞親緣關系、尋找發(fā)現(xiàn)優(yōu)質種源，對褐馬雞的種群發(fā)展和科學保護具有重要的學術價值和現(xiàn)實意義。

ISSR標記作為以PCR為基礎的分子標記，除具有操作簡單、成本低、快速、靈敏的優(yōu)點外，還有所需 DNA模板量少、穩(wěn)定和多態(tài)條帶豐富等優(yōu)點，是研究物種遺傳背景的有效工具。ISSR標記已廣泛應用于植物的遺傳連鎖圖譜構建、種質資源鑒定、基因定位、植物分類、進化和遺傳多樣性等研究[20]，而在動物研究中應用較少[21]，僅有少數(shù)家禽與水產(chǎn)魚蝦蟹的研究。ISSR標記用于瀕危野生動物的研究則更少，僅見東北虎[18](Pantheratigrisaltaica)、金錢豹[22](Pantherapardus)和北海獅[23](Eumetopiasjubatus)、獐(Hydropotesinermis)[24]等研究，而用于珍稀野生鳥類的研究鮮見報道。本研究將ISSR標記技術用于中國特有的瀕危鳥類——褐馬雞的親緣關系研究，擴展了鳥類遺傳背景和系統(tǒng)進化等方面的研究手段，是有意義的嘗試和探索，對其他野生動物的遺傳分析也不失為一種便捷穩(wěn)定的方法。由于采樣數(shù)量及引物數(shù)量較少，檢測到的位點有限，對褐馬雞圈養(yǎng)和野生種群親緣關系的全面評價，有待于進一步深入研究。

致謝：山西省自然保護區(qū)管理站張龍勝教授、山西龐泉溝國家自然保護區(qū)管理站武建勇高級工程師及太原動物園衛(wèi)澤珍副主任、孟慶珍獸醫(yī)師等對樣品采集中給予幫助，特此致謝。

[1] 李宏群, 廉振民, 劉曉莉. 中國褐馬雞的研究現(xiàn)狀及其保護措施. 延安大學學報: 自然科學版, 2009, 28(2): 92- 96.

[2] 張國鋼, 鄭光美, 張正旺, 郭建榮, 王建平, 宮樹龍. 山西蘆芽山褐馬雞越冬棲息地選擇的多尺度研究. 生態(tài)學報, 2005, 25(5): 952- 957.

[3] 武玉珍, 馮睿芝. 褐馬雞的瀕危原因及保護措施. 中國家禽, 2013, 35(8): 49- 50.

[4] 馮寧, 楊淑娟, 徐振武, 高學斌, 王萬云, 尹祚華. 褐馬雞地理種群的遺傳多樣性研究. 陜西師范大學學報: 自然科學版, 2007, 35(S1): 77- 80.

[5] 武玉珍, 王孟本, 張峰. 褐馬雞圈養(yǎng)種群的mtDNA控制區(qū)多態(tài)性. 生態(tài)學報, 2010, 30(11): 2958- 2964.

[6] 武玉珍, 馮睿芝, 張峰. 珍禽褐馬雞線粒體DNA控制區(qū)結構和親緣關系. 生態(tài)學雜志, 2013, 32(12): 3243- 3249.

[7] 武玉珍, 馮睿芝. 褐馬雞圈養(yǎng)種群ISSR標記的遺傳多樣性. 林業(yè)科學, 2013, 49(11): 103- 108.

[8] Zietkiewicz E, Rafalske A, Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, 1994, 20(2): 178- 183.

[9] 吳則焰, 劉金福, 洪偉, 潘東明, 鄭世群, 何中聲. 孑遺植物水松不同年齡級種群遺傳多樣性的ISSR分析. 生態(tài)學雜志, 2012, 31(8): 1911- 1916.

[10] 張杰, 王佳, 李浩宇, 張慧榮, 王迎春. 瀕危植物蒙古扁桃不同地理種群遺傳多樣性的ISSR分析. 生態(tài)學報, 2012, 32(14): 4443- 4452.

[11] 孫利娜, 席夢利, 徐進, 吳祝華, 施季森. 百合輻射突變體的ISSR鑒定技術研究. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2011, (1): 219- 221.

[12] 范付華, 楊勇勝, 李慶宏, 鄧勇, 文曉鵬. 利用ISSR分析技術鑒定貴州枇杷新種質的研究. 北京林業(yè)大學學報, 2012, 34(4): 52- 57.

[13] 劉本英, 李友勇, 唐一春, 王麗鴛, 成浩, 王平盛. 云南茶樹資源遺傳多樣性與親緣關系的ISSR分析. 作物學報, 2010, 36(3): 391- 400.

[14] 嚴華, 張冬梅, 羅玉蘭, 魯琳. 38種國蘭親緣關系的ISSR分析. 分子植物育種, 2010, 8(4): 736- 741.

[15] 權俊萍, 何樹蘭, 彭峰, 鄭玉紅, 夏冰. 部分百里香屬植物分子系統(tǒng)學研究. 西北植物學報, 2008, 28(8): 1566- 1572.

[16] 武玉珍. 瀕危鳥類褐馬雞遺傳多樣性及保護研究 [D]. 太原: 山西大學, 2008: 12- 18.

[17] Abbot P. Individual and population variation in invertebrates revealed by inter-simple sequence repeats (ISSR). The Journal of Insect Science, 2001, 1: 8.

[18] 白秀娟. 圈養(yǎng)東北虎ISSR指紋分析初報. 獸類學報, 2004, 24(1): 90- 92.

[19] 鄭芳, 呂秀玲, 孫紅英, 周開亞, 趙強, 高偉, 徐信榮. ISSR標記在河蟹種質檢測中的應用. 中國水產(chǎn)科學, 2007, 14(1): 46- 51.

[20] 周延清. DNA分子標記技術在植物研究中的應用. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2005: 143- 161.

[21] 林杰君, 鮑毅新, 劉軍, 張旭. ISSR分子標記及其在動物遺傳結構研究中的應用. 生態(tài)學雜志, 2012, 31(5): 1319- 1326.

[22] 朱軍, 王立斌, 郭東龍, 馬恩波, 任竹梅. 基于ISSR標記技術的金錢豹遺傳多樣性分析. 山西大學學報: 自然科學版, 2008, 31(2): 244- 247.

[23] Koyama S, Fujita S, Hirota T, Satoh T, Obara Y, Hoshino H, Wada A, Burkanov V N, Wada K. Genetic structure of steller sea lion (Eumetopiasjubatus) rookeries in the sea of Okhotsk. Zoological Studies, 2008, 47(6): 781- 787.

[24] 林杰君, 鮑毅新, 劉軍, 王艷妮, 張旭. 舟山群島四個養(yǎng)殖獐種群遺傳多樣性和遺傳結構. 生態(tài)學報, 2013, 33(11): 3460- 3469.

Analysis on genetic relationship of Brown-eared pheasant (Crossoptilonmantchuricum) based on ISSR molecular marker

WU Yuzhen1, FENG Ruizhi2, ZHANG Feng3,*

1SchoolofBiologyScienceandTechnology,JinzhongUniversity,Jinzhong030619,China2InstituteofBiomedicalSciences,FudanUniversity,Shanghai200032,China3SchoolofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China

The Brown-eared pheasant (Corossoptilonmantchuricum) is a critically endangered endemic to China, listed in the national first-class protected bird in China. At present, the distribution area of the Brown-eared pheasant was isolated by Yellow River and Taihang Mountains to form the three regions and the three isolated populations. Those isolated geographic populations are the middle population located in Lvliang Mountains, Shanxi; the east population in Dongling Mountains, Beijing and Xiaowutai Mountains, Hebei and the west population in Huanglong Mountains, Shaanxi, among which Shanxi is the distribution center and abundance center of the Brown-eared pheasant. So far the most researches concerning the Brown-eared pheasant mainly focus on biological, ecological, resource investigation and protection. Using molecular biological method to the research of genetic diversity of the Brown-eared pheasant is still at the initial stage. For the protection of germplasm resources of the Brown-eared pheasant and to optimize the genetic structure of captive populations and further reintroduction, we detected the genetic relationship of 35 individuals in two populations in Shanxi from Pangquangou Nature Reserve and Taiyuan Zoo were studied by using ISSR markers. Ten pairs of primers with repeatable clear and stable bands from 20 pairs of ISSR primers for 35 samples of the two populations were selected, and 65 DNA bands were amplified with polymerase chain reactions, 77% of which were polymorphic bands. PhylTools software was used to calculate Nei′s genetic distance and genetic similarity of each individual from the two populations. The analysis from Nei′s genetic distance and genetic similarity of individuals from each other showed that the means of genetic similarity of individuals from the two populations were 0.5061 and 0.7591, and the means of Nei′s genetic distance were 0.4939 and 0.2409, respectively. As a whole, the means of Nei′s genetic distance and genetic similarity of all 35 individuals are 0.3723 and 0.6310, respectively, which indicated that the genetic variation of individuals in the two populations were at low level, with relatively close genetic distance. We also performed cluster analysis using group average clustering method with (0, 1) matrix and Nei′s genetic distance of the 35 individuals. The results showed that the samples with close genetic distance had close genetic relationship. Most individuals from the same population were grouped together; it indicated that those from similar ecological and geographical environment had the closer relationship. The individuals from Pangquangou Nature Reserve had lower genetic similarity and further genetic distance with each other than the individuals from Taiyuan Zoo, which indicated that those from Pangquangou Nature Reserve had further genetic relationship than those from Taiyuan Zoo. This may due to the free-ranging method and the annual supplement of picking up wild eggs and hatching in Pangquangou Nature Reserve. With this approach, we can easily identify genetic relationship of individuals and select those with relatively far genetic distance for high quality germplasm resource. This method would serve as a novel tool in the research of endangered birds.

Crossoptilonmantchuricum; ISSSR; genetic distances; genetic similarity; cluster analysis; genetic relationship

科技部科技基礎性工作專項(2011FY110300); 山西省自然科學基金資助項目(2012011034- 3); 山西省回國留學人員科研資助項目(20100012)和山西省教改資助項目(J2011088)

2014- 08- 05;

2014- 12- 10

10.5846/stxb201408051563

*通訊作者Corresponding author.E-mail: fzhang@sxu.edu.cn

武玉珍,馮睿芝,張峰.基于ISSR分子標記的褐馬雞親緣關系分析.生態(tài)學報,2015,35(4):1059- 1067.

Wu Y Z, Feng R Z, Zhang F.Analysis on genetic relationship of Brown-eared pheasant (Crossoptilonmantchuricum) based on ISSR molecular marker.Acta Ecologica Sinica,2015,35(4):1059- 1067.