劉子童，徐 暉，胡 希，方桂花，張純剛，唐 星

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

二乙氨基硫代甲酸銅（Cu(DDC)2）疏水蛋白納米粒的制備及評價

劉子童，徐 暉，胡 希，方桂花，張純剛，唐 星*

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

目的合成二乙氨基硫代甲酸銅（Cu(DDC)2）并制備其疏水蛋白納米粒，提升其血漿穩(wěn)定性。方法采用透析法制備，通過考察疏水蛋白用量、溶液pH值、凍干保護劑的種類和用量等因素，以粒徑、包封率等為指標(biāo)，選擇最優(yōu)處方。結(jié)果疏水蛋白納米粒的平均粒徑為140.81±45.6，24 h的體外累積釋放量為94.50%，24 h全血漿中降解后剩余量是Cu(DDC)2的2.2倍，長期3個月穩(wěn)定性良好。結(jié)論疏水蛋白包裹的Cu(DDC)2納米粒，外觀、粒徑、包封率、體外釋放、血漿穩(wěn)定性等制劑學(xué)各項指標(biāo)評價良好，具有良好的抗腫瘤應(yīng)用前景。

藥劑學(xué)；二乙氨基硫代甲酸銅（Cu(DDC)2）；疏水蛋白（HPB）；納米粒；凍干保護劑；血漿穩(wěn)定性

自1948年以來，雙硫侖(disulfiram，DSF) 作為戒酒藥被廣泛應(yīng)用于歐洲[1]，近年研究人員發(fā)現(xiàn)DSF具有抗腫瘤活性，并且這種作用與銅離子密切相關(guān)，但是單獨使用銅離子在臨床上并未起到任何作用，只有DSF與銅合用時抗腫瘤作用顯著[2]。研究發(fā)現(xiàn)，DSF獨特的二硫鍵結(jié)構(gòu)能夠與銅離子螯合形成復(fù)合物，這種復(fù)合物即二乙氨基硫代甲酸銅（Cu(DDC)2），結(jié)構(gòu)式見圖1。Cu(DDC)2不僅具有非常強的活性氧（ROS）誘導(dǎo)作用，而且能夠強烈的抑制NFκB的表達(dá)[3]。Cu (DDC)2的抗腫瘤作用產(chǎn)生可能有以下4種機制：1）同時激活ROS-JNK/p38 通路和抑制NFκB通路[4]; 2）與抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)有關(guān)[5]；3）抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ的活性[6]；4）抑制金屬蛋白酶（MMPs）MMP-2和MMP-9的作用[7]。Cu(DDC)2確切抗腫瘤機制還需進一步研究。

Fig.1 The sturcture of Cu(DDC)2圖1 Cu(DDC)2的結(jié)構(gòu)

Cu (DDC)2為中性，在水中溶解度極低（小于0.1 μg·mL-1），在酸中的穩(wěn)定性強于DSF，對于這種新的抗腫瘤化合物的制劑研究，文獻(xiàn)中很少報導(dǎo)。本研究經(jīng)過預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)Cu (DDC)2適合被疏水蛋白包裹形成納米粒注射給藥。

疏水蛋白(hydrophobin)是高等絲狀真菌在特定時期產(chǎn)生的一類具有特殊理化性質(zhì)的小分子量蛋白質(zhì)，大都含有100個氨基酸，分子量大小為10 k Da左右[8]，其結(jié)構(gòu)上比較特殊，既含有親水結(jié)構(gòu)，也含有疏水結(jié)構(gòu)，在整體結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為雙親性，雙親性使得疏水蛋白像表面活性劑一樣，當(dāng)它們遇到親水一疏水界面時，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，就會自我組裝成一層兩親性薄膜[9]。并且研究表明疏水蛋白既無細(xì)胞毒性，也無強免疫原性，Reger[8]和Sarparanta[10]等應(yīng)用其制備了乳劑和多孔硅納米粒。

本文的主要目的是將Cu (DDC)2制成靜脈注射疏水蛋白納米粒載藥系統(tǒng)，以便解決Cu (DDC)2血漿穩(wěn)定性差等問題。本文作者對制劑進行了一系列表征和體外相關(guān)研究，希望能為今后Cu (DDC)2進一步研究提供劑型、制備工藝等方面的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

日立D-7000高效液相色譜儀（Hitachi公司，日本）；DiamonsilTMC18色譜柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm,迪馬公司)；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；透析袋（截留分子量3500 Da,上海綠鳥科技發(fā)展有限公司）；Hitachi H800透射電鏡（日立公司，日本）；Ultra-cell超聲波細(xì)胞粉碎機（Sonics Materials Inc., 美國）；NicompTM380 動態(tài)光散射粒度/zeta-電位測定儀（Santa Barbara,美國）。

雙硫侖（濟南銳晶藥化有限公司）；氯化銅（分析純，山東禹王實業(yè)有限公司）；H Star Proteins B（HPB，德國 BASF公司贈送)；海藻糖（南寧市中諾生物工程有限責(zé)任公司）；麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖、蔗糖（天津博迪化工有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，天津康科德化學(xué)試劑廠）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 Cu(DDC)2的合成

有關(guān)Cu(DDC)2合成研究的報道并不多，本研究采用CuCl2與DSF反應(yīng)，物質(zhì)的量比為1：1[11]，在自然光的條件下反應(yīng)，反應(yīng)介質(zhì)為純化水，反應(yīng)過程如圖2所示。將雙硫侖黃色固體粉末1.74 g (5.868 mmol) 加入到500 mL CuCl2·2H2O (1 g, 5.868 mmol) 藍(lán)色水溶液中（物質(zhì)的量比為1：1），在磁力攪拌條件下持續(xù)攪拌24 h。反應(yīng)過程中內(nèi)容物顏色逐漸由黃綠色變?yōu)樯钭厣?，最后成為黑色，顯示化合物Cu(DDC)2開始形成。

Fig.2 The reaction of DSF and CuCl2in pure water圖2 DSF和CuCl2在水溶液中的反應(yīng)

反應(yīng)完成后，對產(chǎn)物進行純化處理。先將得到的黑棕色沉淀物用布氏漏斗過濾，再用乙醇反復(fù)洗滌3遍以除去未反應(yīng)完全的DSF，得到的產(chǎn)物再用二氯甲烷-水（體積比1:1）在分液漏斗中萃取（200 mL ×3），以除去水溶性雜質(zhì)，最后得到的產(chǎn)物在真空干燥箱中干燥12 h (40℃)，即得純度大于95%的Cu(DDC)2，平均每次反應(yīng)收率達(dá)到90%以上。產(chǎn)物經(jīng)鑒別，均與文獻(xiàn)報導(dǎo)一致。

2.2 Cu(DDC)2疏水蛋白納米粒（Cu(DDC)2-HPB-NPs）的制備

在未明確疏水蛋白的用量之前，考察時預(yù)試驗用量為20 mg·L-1，試驗中主要比較了超聲法和透析法兩種制備工藝。

超聲法: HPB 的PBS溶液，加入Cu(DDC)2的DCM溶液中，冰浴攪拌超聲后，旋蒸除去DCM，完成后過0.45 μm 的濾膜，凍干即得。

透析法：HPB 的PBS溶液，加入Cu(DDC)2的 N,N-二甲基甲酰氨（DMF）溶液，室溫攪拌后，再放入60℃水浴攪拌，冰浴冷卻[11]，裝入透析袋中，透析24 h。透析完成后過0.45 μm 的濾膜，凍干即得。

實驗結(jié)果表明，超聲法雖然能降低粒徑，但是不利于HPB結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；透析法較溫和，雖然透析過程時間較長，但形成的納米粒粒徑均一，且一次制備的制劑量較大。因此本文采用透析法制備Cu(DDC)2-HPB-NPs。實驗中首先考察了制備中的工藝參數(shù)對納米粒質(zhì)量的影響，確定制備工藝后，進行詳細(xì)的單因素處方篩選。最后在單因素考察基礎(chǔ)上，以粒徑大小、包封率和短期穩(wěn)定性作為Cu(DDC)2-HPB-NPs的質(zhì)量評價指標(biāo)。

2.2.1 有機相的選擇

按照有機相既能溶解 Cu(DDC)2又能與水很好互溶的要求，作者選擇了幾種水溶性的有機溶劑（分別為四氫呋喃、DMF、乙醇、乙腈）進行實驗，結(jié)果顯示四氫呋喃和藥物發(fā)生反應(yīng)，乙醇和乙腈對藥物溶解性太差，DMF 對藥物溶解能力最強，因此選用DMF作為有機相。

2.2.2 HPB溶液與Cu(DDC)2溶液的體積比

實驗中考察了有機相與水相體積比不同對包封率(EE%)、zeta電位和平均粒徑(MD)的影響?？疾斓捏w積比分別為：10:0.1、10:0.5、10:1、10:2和10:5。制備過程為：配制20mg·L-1HPB 的PBS溶液作為水相， 0.678 mg·mL-1Cu(DDC)2的DMF溶液作為有機相，用注射器吸取有機相滴加到水相中，以轉(zhuǎn)速100 r·min-1在室溫攪拌10 min，60℃水浴攪拌10 min，透析除去DMF，過濾即得。結(jié)果見表1，比例過大或過小各項指標(biāo)均不符合要求，當(dāng)體積比為10：1時，各項指標(biāo)均符合。

Table 1 Influence of volume ratio of HPB and Cu(DDC)2on EE%, zeta-potential and MD of nanoparticles表 1 HPB和Cu(DDC)2溶液體積比不同對納米粒包封率、zeta電位和粒徑的影響

2.2.3 滴加速度的選擇

其他條件不變?nèi)?.2.2項所示，用注射器吸取有機相, 滴加時間分別為3 s、5 min、9 min，測定納米粒的平均粒徑分別為170.4、191.7、274.9 nm。由結(jié)果可見，滴加速度越快粒徑越小，因此滴加速度以最快速度3 s滴加完全。

2.2.4 攪拌速度的選擇

其他條件不變?nèi)?.2.2項所示，在水浴攪拌速度分別為100 r·min-1和400 r·min-1，粒徑分別為137.4 nm和125.5 nm條件下進行考察。結(jié)果顯示，攪拌速度對粒徑?jīng)]有太大影響，選擇轉(zhuǎn)速100 r·min-1即可。

2.2.5 溶液pH值的選擇

處方前研究表明，Cu(DDC)2在水中溶解度極低，不受溶液pH值的影響，但是HPB水溶液在pH小于6時，溶解性差且極不穩(wěn)定，會產(chǎn)生絮凝。所以在處方篩選中還需考慮制劑pH的控制。實驗中用緩沖鹽配制pH 分別為6.0、7.0、7.5、8.0及9.0的溶液，測定制劑的包封率、zeta電位和粒徑，結(jié)果見表2。在pH值為7.5時，粒徑小于220 nm，包封率較高，隨著pH值升高，包封率下降，粒徑變化不明顯；pH值為6.0時，溶液產(chǎn)生絮狀沉淀，無法分析。因此選擇pH 7.5配制HPB的緩沖液。

Table 2 Influence of pH of HPB solution on EE%, zeta-potential and MD of nanoparticles表 2 不同pH值的HPB溶液對納米粒的包封率、zeta電位和粒徑的影響

2.2.6 HPB溶液濃度的影響

其他條件不變，分別用PBS配制濃度為2、10、20 mg·L-1的HPB溶液[12]進行實驗，結(jié)果見表3。由表3可見，HPB濃度越大粒徑越小，包封率越大。HPB溶液濃度為10 mg·L-1時各項標(biāo)準(zhǔn)符合要求，當(dāng)HPB濃度繼續(xù)增大時，不僅其在水中溶解緩慢而且對制劑沒有任何改善，因此選擇HPB溶液濃度為20 mg·L-1。

Table 3 Influence of HPB concentration on EE%, zeta-potential and MD of nanoparticles表3 不同濃度HPB溶液對納米粒的包封率、zeta電位和粒徑的影響

2.2.7 投藥量的考察

納米粒包封率和穩(wěn)定性與投藥量有著直接的關(guān)系。由于 Cu(DDC)2在水中難溶的性質(zhì)，使其在外水相中很容易超過飽和溶解度，如果投藥量過多，超出了疏水蛋白的承載能力，則會析出黑色藥物影響穩(wěn)定性。實驗中分別配制100、500、800、1000、2000 μg·mL-1的Cu(DDC)2DMF溶液，試驗結(jié)果見表4。由表4可見，投藥量越大，包封率越低，但粒徑都較均一，當(dāng)投藥量大于0.8 mg·mL-1時，納米粒室溫放置數(shù)天易析出結(jié)晶，因此固定投藥量為0.8 mg·mL-1。

Table 4 Influence of Cu(DDC)2concentration on EE%, zeta-potential and MD of nanoparticles表 4 不同濃度Cu(DDC)2溶液對納米粒的包封率、zeta電位和粒徑的影響

2.2.8 凍干保護劑的篩選

凍結(jié)不同的制劑需要不同的保護劑，且濃度也不相同，但至今尚無普遍規(guī)律。糖類、多元醇是凍干品良好的支持劑，既能阻止微粒的融合，又能減少包封藥物的泄漏。凍干時糖類物質(zhì)可形成堅固的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并提供一個相對高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。試驗中以甘露醇、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖和麥芽糖作保護劑，考察比較了凍干后制劑的外觀和再分散后的粒徑保護效果，確定了凍干保護劑的最佳處方和濃度。

實驗操作：分別稱取上述凍干保護劑粉末適量, 乳糖濃度為0.5 g·L-1和0.25 g·L-1，其余濃度均為0.5 g·L-1和1 g·L-1。取Cu(DDC)2-HPB-NPs混懸液置多個10 mL西林瓶中各1 mL，其中一份加純凈水1 mL，其余分別加入保護劑溶液1 mL, 將樣品溶液放入凍干機中冷凍干燥，取出室溫觀察樣品外觀及復(fù)溶情況。以樣品的外觀、復(fù)溶情況以及復(fù)溶前后粒徑大小變化為指標(biāo)，評價凍干保護劑的作用，結(jié)果如表5。

Table 5 Effect of cryoprotectants on the appearance of samples after freeze-drying表 5 不同凍干保護劑對樣品凍干的影響

結(jié)果表明，使用單一凍干保護劑的各制劑中，只有含乳糖、海藻糖的樣品外觀成餅狀，質(zhì)地柔軟，表面實驗平整，凍融后未見明顯粒子聚集現(xiàn)象。未加凍干保護劑、加入葡萄糖、蔗糖和麥芽糖4種方式的制劑粉末外觀均坍塌萎縮在瓶底，凍干保護劑沒有發(fā)揮支撐保護的作用。加入甘露醇制劑外觀良好，但復(fù)溶后粒徑增大2倍。加入兩種凍干保護劑的樣品中，含有乳糖和海藻糖的樣品，外觀良好，復(fù)溶后粒徑變化也都不大，不含有這兩種保護劑的樣品，均不符合要求。因此可以得出乳糖和海藻糖這2種糖類適合作為Cu(DDC)2-HPB-NPs的凍干保護劑。

接下來進一步對其濃度進行了篩選。

實驗操作：分別稱取乳糖和海藻糖粉末適量, 乳糖濃度為0.1、0.25、0.5 g·L-1，海藻糖濃度為0.2、0.5、1.0 g·L-1。其他操作同上，結(jié)果如表6。

Table 6 Effect of different cryoprotectants in freeze-drying on the properties of nanoparticles表6 不同凍干保護劑對樣品凍干后性質(zhì)的影響

以0.1 g·L-1和0.25 g·L-1的乳糖、0.2 g·L-1和0.5 g·L-1的海藻糖作為凍干保護劑，濃度太低，沒有達(dá)到支撐的效果，外觀沒有成餅狀且復(fù)溶后粒徑明顯增大，二者以0.5 g·L-1和0.25 g·L-1濃度合用或單獨以較高濃度0.5 g·L-1和1 g·L-1使用，保護效果較好，復(fù)溶時輕輕振搖即可迅速全部溶解，結(jié)果沒有顯著差異，因此選用濃度相對較低的0.5 g·L-1乳糖作為凍干保護劑。

2.2.9 凍干保護劑的加入方式

凍干保護劑的加入有內(nèi)加和外加兩種方式。內(nèi)加是在制劑的制備過程中將保護劑溶解在水相中；外加是指將保護劑加至已制備好的制劑中，外加時可以將保護劑以固體或濃溶液兩種形式加入。試驗中作者發(fā)現(xiàn)內(nèi)加法會影響制劑的粒度分布，所以操作中采用外加保護劑濃溶液的方式。

處方工藝為：在2 mg·L-1的HPB pH7.5的PBS溶液10 mL中，加入800 μg·mL-1Cu(DDC)2的 DMF溶液1 mL，3 s滴加完全，室溫攪拌10 min，60℃水浴攪拌10 min后冰浴冷卻，裝入透析袋中，透析24 h。透析完成后過0.45 μm 的濾膜，后加入0.5 g·L-1乳糖作凍干保護劑，凍干即得。

2.3 Cu(DDC)2-HPB-NPs制劑學(xué)性質(zhì)評價

2.3.1 外觀

Cu(DDC)2-HPB-NPs呈帶有乳光的澄明液體，肉眼及顯微鏡下均未見不溶性成分。凍干后為疏松狀固體。外觀如圖3所示。

Fig.3 The appearance of Cu(DDC)2-HPB-NPs圖3 Cu(DDC)2-HPB-NPs的外觀

2.3.2 形態(tài)觀察

采用透射電鏡觀察了Cu(DDC)2-HPB-NPs的粒子形態(tài)。實驗方法如下：取Cu(DDC)2-HPB-NPs混懸液適量，加蒸餾水稀釋10倍，取適量滴至覆有支持膜的銅篩網(wǎng)上，自然干燥后，用透射電鏡觀察其形態(tài)，如圖4所示?？梢娂{米粒子呈圓狀，粒徑分布比較均勻。

Fig. 4 TEM image of the Cu(DDC)2-HPB-NPs圖 4 Cu(DDC)2-HPB-NPs的透射電鏡圖

2.3.3 粒徑測定

采用NicompTMPSS 380動態(tài)光散射粒度測定儀測定了Cu(DDC)2-HPB-NPs的粒徑分布，制劑的粒度分布為140.81±45.6 nm。

2.3.4 zeta電位測定

zeta電位是微粒表面荷電大小與荷電性質(zhì)的標(biāo)志，是影響微粒分散制劑體內(nèi)分布與體內(nèi)藥物動力學(xué)行為的重要參數(shù)。試驗中采用了NicompTM380/ZLS 動電電位粒度分析儀測定Cu(DDC)2-HPB-NPs粒子的Zeta電位。制劑的zeta電位為 -15.02 mV。

2.3.5 含量測定方法的建立

2.3.5.1 色譜條件

固定相：Diamonsil C18色譜柱（200 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相：乙腈-0.05mol 磷酸鹽緩沖液（體積比80：20；用磷酸調(diào)節(jié)水相pH7.4）；檢測波長：435 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：25℃；進樣量：20 μL；理論塔板數(shù)以Cu(DDC)2峰計算應(yīng)不低于4000。

2.3.5.2 溶液的配制

對照品溶液：精密稱取干燥后的Cu(DDC)21 mg，置于10 mL量瓶中，加少量DCM超聲溶解并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液；精密量取1 mL對照品儲備液，置100 mL量瓶中，加流動相定容，搖勻，即得理論上10 μg·mL-1的Cu(DDC)2對照品溶液。

供試品溶液： 精密稱定Cu(DDC)2粉末約10 mg至100 mL量瓶中，加少量DCM超聲溶解并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.5.3 專屬性試驗

精密量取空白HPB-NPs 0.5 mL置10 mL離心管中，加入約3 mL乙腈，渦旋振搖，析出沉淀，乙腈定容，離心，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進樣分析，記錄色譜圖；精密量取Cu(DDC)2-HPB-NPs同法操作，記錄色譜圖；配制Cu(DDC)2標(biāo)準(zhǔn)溶液，同法操作，記錄色譜圖。結(jié)果表明HPB-NPs中的成分不干擾Cu(DDC)2的測定，方法專屬性良好。

2.3.5.4 線性相關(guān)性試驗

分別精密量取2.3.5.2項下對照品儲備液稀釋至1、2、5、10、25、50、100 μg·mL-1。分別進樣20 μL，記錄色譜圖，量取峰面積，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以濃度（c）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明在1～100 μg·mL-1范圍內(nèi)Cu(DDC)2的峰面積（A）與濃度（c）有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=5325.3c+3192.6，r=0.9964。

2.3.5.5 精密度試驗

取供試品溶液，連續(xù)進樣6次，計算得Cu(DDC)2峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.3%。取Cu(DDC)26份，依2.3.5.2項下方法制備供試品溶液，分別進樣分析。計算得濃度的RSD為1.22%。結(jié)果表明儀器和方法的精密度良好。

2.3.5.6 回收率試驗

取已知濃度的Cu(DDC)2甲醇溶液，分別精密稱量取1.0 mL置10 mL容量瓶中，共9份，每3個為一組分別加入本底濃度80%、100%和120%的對照品溶液，依2.3.5.4項下操作并測定，計算回收率，結(jié)果見表7。

Table 7 Recoveries of Cu(DDC)2表7 Cu(DDC)2的回收率

2.3.5.7 含量測定方法

精密量取Cu(DDC)2-HPB-NPs 0.5 mL，置10 mL離心管中，加入適量（3 mL左右）乙腈，渦旋振搖，析出沉淀，加入乙腈定容，離心，取上清液0.45 μm濾膜過濾，進樣分析，按外標(biāo)法計算藥物濃度，制劑中Cu(DDC)2濃度為0.3 mg·mL-1。

2.3.6 包封率的測定

取2 mL 納米粒溶液于離心管中，以6000 r·mim-1離心10 min，除去下層未包封的藥物沉淀，游離于溶液中的藥物分子忽略不計。取上層溶液0.5 mL，加入4 mL乙腈，渦旋10 min，6000 r·mim-1離心10 min，取上清液測定含量Cd（藥物總量Ct為加入的理論量）。按公式[包封率% (EE%）=Cd/Ct×100%]計算包封率。結(jié)果顯示Cu(DDC)2-HPB-NPs凍干前和復(fù)溶后的平均包封率為30%。

2.3.7 體外釋藥特性研究

2.3.7.1 體外釋藥測定方法

本實驗中采用動態(tài)透析法測定Cu(DDC)2-HPB-NPs的體外釋藥。透析袋是一種具有分子截留作用的半透膜，試驗中所用的透析袋截留分子量為 3500，分子量小于3500的游離藥物可以自由擴散透過透析袋進入釋放介質(zhì)，而包裹在制劑中的藥物被截留在透析袋內(nèi)緩慢釋放。參照溶解度數(shù)據(jù)，用PBS 8.0緩沖液作釋放介質(zhì)即可達(dá)到漏槽條件。

2.3.7.2 測定實驗和結(jié)果

精密量取Cu(DDC)2-HPB-NPs 2 mL置透析袋中，兩端用透析夾夾緊，置于500 mL錐形瓶中，加入250 mL釋放介質(zhì)，同法制得樣品3份。將錐形瓶放入37℃的水浴振蕩器中，每分鐘振蕩100次，于0 min、15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 時間點從透析袋中取200 μL 樣品，以8000 r·mim-1離心5 min后，用0.45 μm濾膜過濾，最后以HPLC法測定樣品含量。釋放結(jié)果見圖5。

Fig.5 Cumulative release of Cu(DDC)2-HPB-NPs in PBS 8.0圖 5 Cu(DDC)2-HPB-NPs在PBS 8.0介質(zhì)中的累積釋放曲線

由圖可以看出最初幾小時藥物有突釋現(xiàn)象，Cu(DDC)28 h的累積釋放量為74.08%，24 h的釋放量為94.50%，表明Cu(DDC)2-HPB-NPs可實現(xiàn)藥物的體外延緩釋放，但是突釋現(xiàn)象應(yīng)進一步改善和控制。釋放曲線經(jīng)過擬合符合Higuchi 方程，擬合結(jié)果為：y=0.15831t1/2+0.22429, r2=0.97425。

2.3.8 血漿穩(wěn)定性

Cu(DDC)2的血漿穩(wěn)定性：取濃度為 5 mg·mL-1的Cu(DDC)2DMF儲備液 15 μL，分別加入于 37 ℃預(yù)熱的 0.5、2.5、5 mL 新鮮大鼠空白血漿，向每管加入適量生理鹽水使最終體積為 5 mL，搖勻后放置于 37 ℃水浴，分別于 0、0.5、1、2、4、6、8,、10、12、24 h 時間點取樣 100 μL，加 900 μL 乙腈沉淀蛋白，渦旋 10 min，以 13000 r·min-1冷凍離心 10 min，取上清液用HPLC法進樣分析，測定峰面積，以外標(biāo)法計算藥物含量。試驗結(jié)果見圖6。

Fig.6 Stability of Cu(DDC)2during incubation with different concentrations of rat plasma圖 6 Cu(DDC)2在不同濃度大鼠血漿中孵育的穩(wěn)定性

實驗結(jié)果表明Cu(DDC)2在血漿中不穩(wěn)定，血漿濃度越高降解越快，24 h內(nèi)10%、50%、100% 血漿中剩余的Cu(DDC)2百分?jǐn)?shù)分別為：56.83%、34.54%、14.15%。將降解曲線分別用零級、一級、Higuchi 方程及Ritger-Papers 方程進行擬合，Higuchi方程擬合相對較好，說明Cu(DDC)2在不同濃度的血漿中降解動力學(xué)符合Higuchi方程，結(jié)果如表8。

Table 8 Degradation patterns of Cu(DDC)2in rat plasma表 8 Cu(DDC)2大鼠血漿降解動力學(xué)模擬方程

Cu(DDC)2-HPB-NPs的血漿穩(wěn)定性：取0.5 mg·mL-1的Cu(DDC)2-HPB-NPs 0.15 mL，分別加入于37 ℃預(yù)熱的0.5、2.5、5 mL新鮮大鼠空白血漿中，向每管加入適量生理鹽水使最終體積為5 mL，處理和測定方法同上，試驗結(jié)果見圖7。

Fig. 7 Stability of Cu(DDC)2-HPB-NPs during incubation with different concentrations of rat plasma圖 7 Cu(DDC)2-HPB-NPs在不同濃度大鼠血漿中孵育的穩(wěn)定性

由圖7可見，試驗結(jié)果與Cu(DDC)2的血漿降解穩(wěn)定性結(jié)果相同。在10%、50%、100%的血漿溶液中24 h后，Cu(DDC)2-HPB-NPs中Cu(DDC)2的剩余量為60.32%、44.87%、31.45%。降解曲線用Higuchi方程擬合結(jié)果見表 9。

Table 9 Degradation patterns of Cu(DDC)2-HPB-NPs in rat plasma表 9 Cu(DDC)2-HPB-NPs大鼠血漿降解動力學(xué)模擬方程

2.3.9 長期穩(wěn)定性

將凍干樣品在冰箱冷藏（4℃）干燥保存，考察制劑的長期穩(wěn)定性。如表10所示，儲藏溫度對制劑的穩(wěn)定性影響較大。凍干后的Cu(DDC)2-HPB-NPs樣品在冰箱冷藏干燥條件下保存3個月時，制劑的外觀、粒徑和包封率等性質(zhì)均沒有改變，室溫放置的樣品僅能存放1個月，1個月后的制劑外觀就有所塌陷，樣品不能完全水化。

Table 10 Stability of lyophilized Cu(DDC)2-HPB-NPs at 4℃表 10 凍干Cu(DDC)2-HPB-NPs在4℃保存的穩(wěn)定性

3 討論

3.1 Cu(DDC)2的合成

DSF與CuCl2以物質(zhì)的量比1：1反應(yīng)，生成產(chǎn)物產(chǎn)率最高（大于90%），當(dāng)比例改變時，反應(yīng)物過剩，會干擾產(chǎn)物的純化。CuCl2可以用任何二價銅離子代替，如CuSO4，產(chǎn)物溶液的pH 值也會隨之改變。光照和室溫對反應(yīng)影響不大，可以忽略不計。但是反應(yīng)必須在純水溶液中進行，在緩沖鹽中反應(yīng)生成率會大大降低（低于40%）。在有機溶劑中反應(yīng)則會生成雙二乙基烯氨四硫代環(huán)己烷二價陽離子（bis(dialkyliminium)-tetrathiolane dication, Bitt-42+）和Cu+[8]，反應(yīng)過程如圖8所示。因此反應(yīng)過程中應(yīng)避免緩沖鹽和有機溶劑，以免阻礙反應(yīng)進行。

Fig.8 The reaction of DSF and CuCl2in organic solvent圖 8 DSF和CuCl2在有機溶劑中的反應(yīng)

3.2 處方和制備工藝的考察

Cu(DDC)2的油水分配系數(shù)C㏒P=1.51，水溶性極差，脂溶性也不好，利用SDS、PEG、吐溫等表面活性劑使其形成混懸液，增溶作用很不顯著。但是與疏水蛋白溶液混合后，疏水蛋白能利用其自身結(jié)構(gòu)的變化，將疏水端包裹 Cu(DDC)2，再將親水端朝外，形成了穩(wěn)定均勻的納米粒，使Cu(DDC)2實現(xiàn)了體內(nèi)給藥。本Cu(DDC)2-HPB-NPs處方簡單，只加入了低比例的疏水蛋白、調(diào)節(jié)pH值的緩沖鹽和凍干保護劑，沒有額外增加表面活性劑等物質(zhì)，安全性良好。

3.2 血漿穩(wěn)定性的提高

Cu(DDC)2在體內(nèi)很快被代謝為甲基-DDC和二乙氨，并被繼續(xù)代謝，最終排出體外，其在體內(nèi)穩(wěn)定性差一直是限制其作用發(fā)揮的主要因素。大鼠血漿降解實驗中，在10%, 50%和100%的血漿中孵化24 h，制劑Cu(DDC)2-HPB-NPs血漿中殘余量分別是Cu(DDC)2化合物的1.06、1.29和2.22倍，這說明HPB外殼能夠保護Cu(DDC)2，使其降解反應(yīng)減緩。

4 結(jié)論

合成了 Cu(DDC)2并制備其疏水蛋白納米粒，24 h體外釋放良好。比較了 Cu(DDC)2和Cu(DDC)2-HPB-NPs的體外血漿穩(wěn)定性，疏水蛋白納米粒有效地減少了降解，延長了藥物在血漿中的作用時間。

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Preparation of bis(diethyldithiocarbamate) Cu(II) hydrophobin nanoparticles and its quality evaluation

LIU Zi-tong, XU Hui, HU Xi, FANG Gui-hua, ZHANG Chun-gang, TANG Xing*
（School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China）

ObjectiveTo synthesize Bis(diethyldithiocarbamate) Cu(II) and prepare drug loaded nanoparticles with hydrophobin intended to improve the stability of Bis(diethyldithiocarbamate) Cu(II) in plasma.MethodsThe nanoparticles were prepared by dialysis method. The influences of hydrophobin concentration, pH of solution, various types and concentrations of cryoprotectants were investigated with respect to mean particle size distribution, encapsulation efficiency and zeta-potential. The optimal formulation was selected. Results The results of electron micrograph and the size distribution show that the nanoparticles were small and spherical, and the mean diameter of nanoparticles was 140.81±45.6 nm. Thein vitro release of Cu(DDC)2-HPB-NPs reached up to 94.50% in 24 h and the stability of Cu(DDC)2in rat plasma was enhanced to be of 2.2 times in 24 h by being encapsulated in particles of HPB-NPs. The long term storage stability was good in 3 month.ConclusionThe satisfactory appearance, particle size, entrapment efficiency and in vitro release of formulation Cu(DDC)2-loaded hydrophobin nanoparticles show its good application prospect in antitumor therapy.

pharmaceutics; bis(diethyldithiocarbamate) Cu(II)（Cu(DDC)2）; hydrophobin（HPB）; nanoparticles; cryoprotectants; plasma stability

:: R 94

：A

(本篇責(zé)任編輯：時碩坤)

（2015）01-0013-14

10.14146/j.cnki.cjp.2015.01.002

2014-04-24

劉子童(1987-), 女(漢族), 遼寧鐵嶺人, 碩士, Tel. 024-23986343, E-mail liu-zi-tong@163.com; ***

：唐星(1964-), 男(漢族), 陜西商縣人, 教授, 博士, 主要從事口服微粒緩控釋制劑和中藥現(xiàn)代化研究, Tel. 024-23986343, E-mail tanglab@126.com.