李 慧，張 起，趙燕芳，劉曉紅，張向榮

(沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

抗痛風(fēng)藥SE-10平衡溶解度、表觀油水分配系數(shù)及解離常數(shù)的測(cè)定

李 慧，張 起，趙燕芳，劉曉紅*，張向榮*

(沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

目的建立SE-10含量測(cè)定方法，并測(cè)定其理化常數(shù)，為其制劑開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。方法采用HPLC法測(cè)定SE-10在37 ℃不同pH緩沖溶液中的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)；采用紫外吸光度法對(duì)SE-10的解離常數(shù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果SE-10的平衡溶解度隨pH的增加而增加；表觀油水分配系數(shù)與之相反；pH6.8時(shí)，SE-10的平衡溶解度為237.1 μg·mL-1，logP值為1.68；SE-10的pKa值為4.34。結(jié)論SE-10為難溶性藥物，其具有適宜的解離常數(shù)和脂溶性，在腸道很容易被吸收。

藥劑學(xué)；SE-10；理化常數(shù)；平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)；解離常數(shù)

痛風(fēng)是由于嘌呤代謝紊亂，尿酸產(chǎn)生過(guò)多或尿酸排泄量減少，血液中尿酸濃度持續(xù)增高導(dǎo)致其在關(guān)節(jié)、軟骨和腎臟中析出形成結(jié)晶鹽沉淀而引起的組織異物性炎性疾病[1]。有文獻(xiàn)顯示，痛風(fēng)與糖尿病、胰島素抵抗、高血壓、高脂血癥及心血管疾病等病癥相關(guān)[2-3]。

Fig.1 Structure of SE-10圖1 SE-10的結(jié)構(gòu)

SE-10（圖1）化學(xué)名為2-（3-氰基-4-異丁氧基苯基）-4-甲基-5-硒唑甲酸），是以非布司他為原型全新合成的一類弱酸性藥物[4]。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SE-10可有效降低高尿酸患者的血尿酸濃度，作用與非布索坦相當(dāng)。對(duì)于弱酸性或弱堿性藥物，由于受到胃腸道 pH的影響，藥物會(huì)以分子型和離子型兩種形式存在。根據(jù) pH-分配假說(shuō)（pH-partition hypothesis），藥物的吸收取決于藥物的解離狀態(tài)和油水分配系數(shù)，只有分子型的、脂溶性大的藥物才能透過(guò)細(xì)胞膜被人體所吸收。對(duì)于口服固體制劑，胃腸道的脂溶性細(xì)胞膜為影響藥物吸收的主要屏障，若藥物的水溶性強(qiáng)而脂溶性差，則不能透過(guò)細(xì)胞膜被人體吸收；當(dāng)然，若藥物的脂溶性太強(qiáng)，則藥物與細(xì)胞磷脂膜融合后不易被釋放出來(lái)也無(wú)法被人體吸收。表觀油水分配系數(shù)是反應(yīng)藥物的脂溶性的重要參數(shù)。因此，SE-10理化常數(shù)的測(cè)定對(duì)其制劑的開(kāi)發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。

1 儀器與材料

Waters 2489 UV/Visible Detector和Waters e2695 Separations Module 高效液相色譜儀（沃特世科技(上海)有限公司 ）；Adventure電子分析天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司）；UV-1801型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；XW-80渦旋混合儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；HZQ-C 空氣振蕩浴 (哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造）；LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

SE 10原料（自制，純度＞99.1%）；磷酸氫二鉀（分析純，天津博迪化工有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津博迪化工有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純，天津博迪化工有限公司）；十二烷基硫酸鈉（安徽山河藥用輔料股份有限公司）；正辛醇（分析純，天津市康科德科技貿(mào)易有限公司）；無(wú)水乙醇（色譜純，天津市康科德貿(mào)易有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.5g·L-1磷酸水溶液（體積比60 : 40）；檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性

稱取SE-10約25 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，乙腈溶解并定容至刻度，制成濃度為501.2 mg·L-1的母液；精密移取1 mL母液至10 mL量瓶中，加入乙腈稀釋定容，制成SE-10質(zhì)量濃度為50 mg·L-1的溶液作為樣品溶液；以乙腈作為空白溶劑，按上述色譜條件進(jìn)行操作，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，溶劑不干擾原料藥的測(cè)定，方法專屬性好。

Fig.2 Chromatograms of blank solution (A) and SE-10(B)圖2 空白溶劑（A）和SE-10（B）色譜圖

2.2.2精密度

按“2.2.1”項(xiàng)下樣品溶液配制方法制備含SE-10約為50 mg·L-1的溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積。結(jié)果RSD %= 1.93，系統(tǒng)精密度良好。

稱取25 mg 的SE-10原料藥6份，精密稱定，同法配制成含SE-10為50 mg·L-1的供試品溶液，外標(biāo)法計(jì)算含量。6個(gè)樣品含量測(cè)定結(jié)果的RSD%為 0.21，方法精密度良好。

2.2.3 準(zhǔn)確度

精密稱取SE-10原料藥 4、5、6 mg各3份，置于100 mL量瓶中，加入乙腈溶解定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液備用，作為供試品溶液；精密稱取SE-10對(duì)照品適量，同法操作，作為外標(biāo)對(duì)照溶液。精密量取10 μL供試品溶液和外標(biāo)對(duì)照溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算藥物濃度，求回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

Table 1 Results of recovery experiments of SE-10表1 SE-10回收率試驗(yàn)

結(jié)果顯示，回收率RSD%=0.63，方法可準(zhǔn)確測(cè)定SE-10的含量。

2.2.4 檢測(cè)限、定量限及標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密量取“2.2.1”專屬性項(xiàng)下制備的母液1 mL逐級(jí)稀釋，精密量取稀釋樣品10 μL注入液相色譜儀，記錄測(cè)譜圖。當(dāng)信噪比為10時(shí)的樣品濃度即為定量限，信噪比為3時(shí)的樣品濃度即為檢測(cè)限。試驗(yàn)結(jié)果表明，建立的含量測(cè)定方法的定量限為0.035 mg·L-1，檢測(cè)限為0.01 mg·L-1。

精密量取“2.2.1”專屬性項(xiàng)下制備的母液0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、2.0 mL至10 mL量瓶中，加入乙腈稀釋定容，制得濃度分別為10.02、20.05、40.10、50.12、60.14、80.19、100.24 mg·L-1的溶液，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量下限為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液最低點(diǎn)。精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以SE-10的質(zhì)量濃度ρ（mg·L-1）為橫坐標(biāo)，以色譜峰峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=375 90ρ-338 3.8，r=0.999 9。結(jié)果表明，在0.035～100.24 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2.1”項(xiàng)下樣品溶液配制方法制備含SE-10約為50 mg·L-1的溶液，于室溫、陽(yáng)光不直射的條件下放置，于0、2、4、6、8、10、12 h取樣，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密量取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。結(jié)果顯示，12 h內(nèi)SE-10色譜峰峰面積的RSD%小于2%，表明樣品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 SE-10平衡溶解度的測(cè)定[5]

SE-10為難溶性藥物，幾乎不溶于水，所以測(cè)定SE-10在不同pH中的平衡溶解度，可為指導(dǎo)制劑劑型的研發(fā)及體外溶出介質(zhì)的篩選提供依據(jù)。

取SE-10原料過(guò)量，置于玻璃試管中，分別加入不同pH值的緩沖液（pH 1.2、pH 3.6、pH 4.5、pH 5.8、pH 6.8、pH 7.2），渦旋至藥物不再溶解（可酌情添加原料藥，確保試管中有未溶的藥物存在）。將試管放入空氣恒溫振蕩器中，于37 ?C 振搖72 h。將飽和SE-10溶液以3500 r·min-1離心10 min，取上層澄清溶液，再以130 00 r·min-1離心10 min，取上層澄清溶液，用乙腈稀釋至適宜濃度后，采用高效液相法測(cè)定。另取對(duì)照溶液，同法測(cè)定，按照外標(biāo)法計(jì)算藥物在不同溶液中的平衡溶解度。結(jié)果見(jiàn)表2。

Table 2 Equilibrium solubility of SE-10 in PBS at different pH (37 ℃)表2 SE-10在不同pH緩沖液中的平衡溶解度

Fig.3 The equilibrium solubility of SE-10 in PBS at different pH圖3 SE-10在不同pH緩沖液中平衡溶解度趨勢(shì)線

2.4 表觀油/水分配系數(shù)的測(cè)定

正辛醇的溶解度參數(shù)δ為10.24，與細(xì)胞磷脂膜的溶解度參數(shù)（δ=10.3）最為接近，最能模擬藥物在體內(nèi)的體液與細(xì)胞磷脂分配情況，常被用作有水分配系數(shù)測(cè)定的油相。試驗(yàn)操作如下。

精密稱取SE-10適量，以被水飽和的正辛醇為溶劑，配制成濃度為0.3 mg·mL-1的溶液。精密量取上述SE-10正辛醇溶液0.5 mL作為油相，分別加入已被正辛醇飽和的PBS 1.2、PBS 2.0、PBS 3.6、PBS 4.5、PBS 5.8、PBS 6.8、PBS 7.2的溶液5 mL作為水相，將混合溶液置于37℃空氣恒溫振蕩器內(nèi)平衡72 h[5-6]，使系統(tǒng)達(dá)到萃取平衡。取出樣品，于3500 r·min-1離心10 min，精密量取上層油相0.1 mL于5 mL量瓶中，乙腈稀釋定容，采用高效液相色譜法測(cè)定油相中藥物濃度。計(jì)算公式如下：

公式中，ρw為SE-10分配平衡時(shí)水相中藥物濃度（mg·L-1）；ρo和ρ為分別為平衡前后正辛醇層中的藥物濃度（mg·L-1）；Vo和Vw分別為平衡體系中正辛醇相和水相的體積（mL）；Po/w為SE-10的表觀油/水分配系數(shù)。

根據(jù)上述公式計(jì)算SE-10在各pH值條件下的Po/w值，結(jié)果見(jiàn)表3。

Table 3 logP of SE-10 at different pH表3 SE-10在不同pH下的logP值

Fig.4 The apparent oil/water partition coefficient of SE-10 in PBS-octanol system at different pH圖4 SE-10在不同pH緩沖液-正辛醇體系中表觀油水分配系數(shù)趨勢(shì)線

2.5 解離常數(shù)的測(cè)定

對(duì)于弱酸性或弱堿性藥物，由于受到胃腸道 pH的影響，藥物會(huì)以分子型和離子型兩種形式存在。只有分子型、脂溶性大的藥物才能透過(guò)細(xì)胞膜被人體所吸收。根據(jù) pH-分配假說(shuō)（pH-partition hypothesis），藥物的吸收取決于藥物的解離狀態(tài)和油水分配系數(shù)。對(duì)于 SE-10這種弱酸性藥物，其未解離型濃度Cu和解離型Ci存在如下關(guān)系，

式中pKa為解離常數(shù)（dissociation constant），又叫做電離平衡常數(shù)或電離常數(shù)，用符號(hào)K表示。一種弱電解質(zhì)的解離常數(shù)只與溫度有關(guān)，而與該電解質(zhì)的濃度無(wú)關(guān)。由此可知，pKa可以用來(lái)預(yù)測(cè)藥物在不同環(huán)境下的存在狀態(tài)，亦是制劑研發(fā)所需要的重要參數(shù)。

測(cè)定解離常數(shù)的方法包括電位滴定法、分光光度法、電導(dǎo)法以及毛細(xì)管電泳法。其中分光光度法以操作簡(jiǎn)單、適用范圍廣而得到廣泛應(yīng)用。本文采用紫外分光光度法測(cè)定SE-10的解離常數(shù)。

根據(jù)SE-10結(jié)構(gòu)式分析可知，SE-10是一元弱酸類藥物。一元弱酸在水中達(dá)到電離平衡以后，存在如下關(guān)系：

本文作者采用分光光度法測(cè)定弱酸的解離常數(shù)，其原理基于弱酸藥物在強(qiáng)酸性溶液中全部為分子型[HA]，而在強(qiáng)堿性溶液中全部解離為離子型[A-]，因此可以強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性緩沖液為溶劑測(cè)出藥物在特定波長(zhǎng)（λ）時(shí)的完全分子型和完全離子型的吸光度AM和AI，在其他適宜pH 緩沖液中在相同波長(zhǎng)處測(cè)出同濃度弱酸溶液的吸收度A為分子型和離子型的混合吸收度，即：

上式中AI為在測(cè)定波長(zhǎng)下離子型吸收度，AM為在測(cè)定波長(zhǎng)下分子型吸收度。FI為離子型濃度在總濃度的分?jǐn)?shù)，則：

同理，F(xiàn)M為分子型濃度在總濃度的分?jǐn)?shù)，則：

根據(jù)Beer 定律：A = εFcl，則有：

如果每次測(cè)量的總濃度相同，則A 可替代ε，則有：

因此可以求出解離常數(shù)：

2.5.1 儲(chǔ)備液的制備

稱取SE-10約5 mg，置于100 mL量瓶中，加入少量無(wú)水乙醇超聲溶解，冷卻至室溫，乙醇稀釋至刻度。

2.5.2 pKa的測(cè)定

精密移取2 mL儲(chǔ)備液6份，置于10 mL量瓶中，分別加入0. 1 mol·L-1NaOH 、0. 1 mol·L-1HCl溶液和pH 值約為3.8、4.0、4.3、4.7的磷酸鹽緩沖液（精密測(cè)定pH）稀釋定容，搖勻，測(cè)定各容量瓶藥液在326 nm處的吸光度（A），計(jì)算pKa。結(jié)果見(jiàn)表4。

Table 4 The results of dissociation constant determination表4 解離常數(shù)測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

SE-10為弱酸性藥物，其平衡溶解度具有pH依賴性，隨著pH的增加而增加，但其溶解度仍偏低。SE-10的表觀油水分配系數(shù)隨pH的增大而減小，在不同pH水相測(cè)定的表觀油水分配系結(jié)果表明SE-10具有較好的脂溶性，推測(cè)藥物容易透過(guò)細(xì)胞膜被人體吸收。正常小腸pH約為7，通常pKa＞3.0的弱酸性藥物和pKa＜7.8的堿性藥物很容易吸收，試驗(yàn)測(cè)得SE-10的pKa為4.34，綜合其脂溶性測(cè)定結(jié)果，可以預(yù)測(cè)，SE-10在胃腸道容易被吸收，比較適宜做成口服制劑。這為SE-10的口服制劑開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

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Determination of equilibrium solubility, apparent oil/water partition coefficient and dissociation constant of antigout drug SE-10

LI Hui, ZHANG Qi, ZHAO Yan-fang, LIU Xiao-hong*, ZHANG Xiang-rong*
(School of pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

objectiveTo establish a method for determination the content of SE-10, determinate its physicochemical constants, and provide theoretical basis for the development of preparations.MethodsHigh performance liquid chromatography method was established to measure equilibrium solubility, apparent oil/water partition coefficient of SE-10 at 37 ℃ in buffer solution at various pH. The pKa was determined by UV method.ResultsThe equilibrium solubility of SE-10 increased with increase in pH, and apparent oil/water partition coefficient decreased inversely. Equilibrium solubility was 237.1μg·mL-1and logP was 1.68 when the pH was 7.0. The pKa calculated by UV absorbance was 4.34.ConclusionsSE-10 is slightly soluble. Appropriate dissociation constant and lipophilicity of SE-10 suggest that it would be absorbed easily by intestine, and this provides the theoretical basis for development of SE-10 oral preparation.

pharmaceutics; SE-10; physicochemical constants; equilibrium solubility; apparent oil/water partition coefficient; dissociation constant

R94

：A

(本篇責(zé)任編輯：時(shí)碩坤)

（2015）01-0027-08

10.14146/j.cnki.cjp.2015.01.003

2014-04-15

李慧（1988-）, 女（漢族）, 遼寧錦州人, 碩士研究生, E-mail yaojilihui@126.com; *

：劉曉紅（1977-）, 女（漢族）, 遼寧沈陽(yáng)人, 講師, 主要從事新藥研究與開(kāi)發(fā), Tel. 024-23986325, E-mail LVJ221@163.com;張向榮（1969-）, 女（漢族）, 遼寧遼陽(yáng)人, 副教授, 主要從事藥物動(dòng)力學(xué)研究, Tel. 024-23986521, E-mail xrzhxr@126.com。